Name: cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Wij willen Jonathan Cooper Lab bij Fred Hutchinson Cancer Research Center bedanken voor de toestemming om hun cryostaat te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door NIH en de WM Keck Foundation. BM is een Gordon en Betty Moore fellow van Life Science Research Foundation. We zijn dankbaar voor Daniel Gottschling voor het delen van zijn bevestiging protocol met ons op.

1. Bevestiging Gist Gemeenschappen <ol><li> Gist gemeenschappen groeien op een membraanfilter (bijvoorbeeld Millipore MF membraanfilter; Figuur 2A). Dit komt overeen met een typische gemeenschap van minder dan 2x10 8 cellen op een 6 mm diameter membraanfilter. </li><li> Gebruik een stuk Whatman 541 filtreerpapier op de bodem van een 1 cm diameter en (Figuur 2B) omvat. Dit Whatman papier gebruikt als drager om de gemeenschap dragen in latere stadia. Voeg 1 ml 100% m...

<ol>
	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

De procedure hier gepresenteerde biedt een manier om de interne structuur van gist gemeenschappen te inspecteren. De methanol fixeerstap maakt de gistkolonie starre 8 en bewaart de integriteit van de kolonie, maar veroorzaakt ook krimp 8 die moet worden gehouden bij het ​​interpreteren van de resultaten. We meestal zien rond de 30% krimp in de hoogte van gist kolonies, in vergelijking met kolonies rechtstreeks ingebed in OCT zonder bevestiging 9. Om te vo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> 100% Methanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek oktober Compound </td><td> Andwin Wetenschappelijke </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grade nr. 541 Kwantitatieve Filterpapier </td><td> Whatman papier </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF Membraan Filter </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

Microben typisch leven in gemeenschappen. De ruimtelijke organisatie van cellen in een gemeenschap wordt verondersteld om de overleving en functie van de gemeenschap 1 beïnvloeden. Optische sectie technieken, met inbegrip van confocale en twee-foton microscopie, nuttig zijn gebleken voor het observeren van ruimtelijke organisatie van bacterien en archaea gemeenschappen 2,3. Een combinatie van confocale beeldvorming en fysische snijden van gistkolonies blijkt interne organisatie van cellen 4. Heeft echter directe optische sectie met behulp van confocale of twee-foton microscopie geweest alleen in staat om een ​​paar cellagen diep in gist kolonies te bereiken. Deze beperking is waarschijnlijk vanwege sterke lichtverstrooiing uit gistcellen 4. Hier presenteren we een methode op basis van de vaststelling en cryosectioning tot ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen te verkrijgen in Saccharomyces cerevisiae gemeenschappen. We gebruiken methanol als fixeermiddel agensde ruimtelijke verdeling van cellen behouden. Vaste gemeenschappen worden geïnfiltreerd met OCT verbinding, bevroren, en cryosectioned in een cryostaat. Fluorescentie beeldvorming van de secties onthult de interne organisatie van fluorescerende cellen binnen de gemeenschap. Voorbeelden van gist gemeenschappen bestaande uit stammen die rood en groen fluorescerende eiwitten vertonen de potentialen van de cryosectioning methode om de ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen onthullen evenals die van genexpressie in gistkolonies 2,3. Hoewel onze nadruk lag op Saccharomyces cerevisiae Gemeenschappen kan dezelfde werkwijze mogelijk worden toegepast op andere microbiële onderzoeken.

Fluorescentiebeelden verticale dwarsdoorsneden van gist gemeenschappen die rood en groen gelabeld concurrerende populaties 6 worden weergegeven in figuur 3. Deze gemeenschappen bestaan ​​uit twee prototrofe stammen van gist en hun concurrentie voor gedeelde bronnen, waaronder ruimte tot zuilvormige patronen 7, zoals weergegeven in de verticale doorsneden. Resoluties tot een cel kunnen worden opgelost in dwarsdoorsneden. Figuur 3 vergelijkt dwarsdoorsneden van h...

Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

We presenteren een protocol voor het invriezen en cryosectioning gist gemeenschappen om interne patronen van fluorescerende cellen te observeren. De methode is gebaseerd op methanol-fixing en OCT-inbedding van de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden zonder het inactiveren van fluorescerende eiwitten binnen een gemeenschap.

Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flash Invriezen en Cryosectioning E12.5 hersenen van muizen

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Microbiële gemeenschappen in de natuur en laboratorium - Interview

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie van microbiële gemeenschappen - Interview

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomische MRI - een openbare hulpbron voor het bestuderen van Sequence patronen binnen Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...