Name: cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Nous tenons à remercier Jonathan Cooper Lab au Fred Hutchinson Cancer Research Center for la permission d&#39;utiliser leur cryostat. Ce travail a été soutenu par le NIH et la WM Keck Foundation. BM est un garçon Gordon et Betty Moore Foundation de la recherche Sciences de la Vie. Nous sommes reconnaissants à Daniel Gottschling pour avoir partagé son protocole de fixation avec nous.

1. Fixation Communautés de levure <ol><li> Cultiver les communautés de levure sur une membrane (par exemple, filtre à membrane Millipore MF; figure 2A) de filtre. Ce protocole correspond à une communauté typique de moins de 2x10 8 cellules sur un filtre à membrane 6 mm de diamètre. </li><li> Utilisez un morceau de papier filtre Whatman 541 pour couvrir le fond d&#39;un 1 cm de diamètre ainsi (figure 2B). Ce papier Whatman sera utilisé comme support pour tr...

<ol>
	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

La procédure présentée ici offre un moyen d&#39;inspecter la structure interne des communautés de levure. L&#39;étape de fixation méthanol rend la colonie de levure rigide 8 et préserve l&#39;intégrité de la colonie, mais il provoque aussi le point 8 de retrait qui doit être pris en compte dans l&#39;interprétation des résultats. Nous observons habituellement autour de 30% de rétrécissement dans la hauteur de colonies de levures, par rapport aux colonies directement intégrés dans un...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Le méthanol 100% </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek composé OCT </td><td> Andwin scientifique </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman grade n ° 541 Papier filtre quantitatif </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF filtre à membrane </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

Les microbes vivent généralement dans les communautés. L&#39;organisation spatiale des cellules à l&#39;intérieur d&#39;une communauté est censé avoir un impact sur ​​la survie et la fonction de la communauté 1. Techniques optiques de sectionnement, y compris la microscopie confocale et biphotonique, se sont avérées utiles pour observer l&#39;organisation spatiale des communautés bactériennes et Archaea 2,3. Une combinaison de la microscopie confocale et sectionnement physique de colonies de levures a révélé organisation interne des cellules 4. Cependant, directe sectionnement optique en utilisant la microscopie confocale ou à deux photons a été seulement en mesure d&#39;atteindre quelques couches cellulaires profondes dans les colonies de levures. Cette limitation est probablement en raison de forte diffusion de la lumière à partir de 4 cellules de levure. Ici, nous présentons une méthode basée sur la fixation et découpe au cryostat à obtenir la distribution spatiale des cellules fluorescentes au sein des communautés de Saccharomyces cerevisiae. Nous utilisons le méthanol comme agent fixateurà préserver la répartition spatiale des cellules. Communautés fixes sont infiltrés par composé OCT, congelés et cryosectioned dans un cryostat. L&#39;imagerie par fluorescence des sections révèle l&#39;organisation interne des cellules fluorescentes sein de la communauté. Des exemples de communautés de levures consistant en souches exprimant rouges et verts protéines fluorescentes en évidence les potentialités du procédé découpe au cryostat pour révéler la distribution spatiale des cellules fluorescentes ainsi que celui de l&#39;expression des gènes dans les colonies de levure 2,3. Même si notre accent a été mis sur les communautés de Saccharomyces cerevisiae, la même méthode peut potentiellement être utilisée pour examiner les autres communautés microbiennes.

Images de fluorescence des coupes verticales des communautés de levure contenant rouges et verts marqués populations compétitifs 6 sont représentés à la figure 3. Ces communautés sont constituées de deux souches de levure prototrophes et leur concurrence pour les ressources partagées, y compris l&#39;espace, conduit à colonnes modèles 7, tel qu&#39;il apparaît dans les coupes verticales. Résolutions allant jusqu&#39;à une seule cellule peut être résolu en sections. ...

Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Nous présentons un protocole de congélation et de découpe au cryostat communautés de levure pour observer les modèles internes de cellules fluorescentes. La méthode repose sur la fixation et le méthanol octobre-enrobage à préserver la répartition spatiale des cellules sans inactivation des protéines fluorescentes dans une communauté.

Découpe au cryostat Communautés de levure pour examen des caractéristiques de fluorescence

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flash de congélation et Cryosectioning E12.5 cerveau de souris

Recherche

Biologie

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Les communautés microbiennes dans la Nature et de laboratoire - Interview

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie des communautés microbiennes - Interview

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomic IRM - une ressource publique pour l&#39;étude des schémas de séquence dans l&#39;ADN génomique

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactif In situ D&#39;hybridation pour détecter divers profils d&#39;expression génique dans les tissus

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...