Name: cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00
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Wir möchten Jonathan Cooper Lab am Fred Hutchinson Cancer Research Center für die Erlaubnis, ihre Kryostat verwenden danken. Diese Arbeit wurde vom NIH und der WM Keck Foundation unterstützt. BM ist ein Gordon und Betty Moore Fellow Life Science Research Foundation. Wir sind dankbar, dass Daniel Gottschling für die gemeinsame Nutzung seiner Befestigung Protokoll mit uns.

Ein. Befestigung Hefe Gemeinschaften <ol><li> Wachsen Hefe Gemeinden auf einem Membranfilter (zB Millipore MF Membranfilter; 2A). Dieses Protokoll entspricht einer typischen Gemeinschaft von weniger als 2x10 8 Zellen auf einer 6 mm-Durchmesser-Membranfilter. </li><li> Mit einem Stück Whatman 541 Filterpapier, um den Boden eines 1 cm Durchmesser und (2B) abzudecken. Diese Whatman Papier als Träger, um die Gemeinschaft in späteren Stadien übertragen werden. 1 ml ...

<ol>
	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

Das hier vorgestellte Verfahren bietet eine Möglichkeit, die innere Struktur des Hefe-Communities zu inspizieren. Das Methanol Fixierschritt macht die Hefekolonie starren 8 und bewahrt die Integrität der Kolonie, aber es verursacht auch Schrumpfung 8, sollte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Wir in der Regel sehen rund 30% Schrumpfung in Höhe von Hefe-Kolonien im Vergleich zu Kolonien direkt in OCT ohne Befestigungsmaterial 9 eingebettet. <p class="jove...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 100% Methanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek OCT Compound </td><td> Andwin Scientific </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grade Nr. 541 Quantitative Filter Paper </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF Membrane Filter </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

Mikroben leben typischerweise in den Gemeinden. Die räumliche Organisation von Zellen innerhalb einer Gemeinschaft wird angenommen, dass das Überleben und die Funktion der Reisenden 1 auswirken. Optische Schnitte Techniken, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, haben sich bewährt zur Beobachtung räumlichen Organisation von Bakterien und Archaeen Gemeinden 2,3. Eine Kombination von konfokale Bildgebung und physikalische Schnitte von Hefe-Kolonien hat interne Organisation von Zellen 4 enthüllt. Allerdings hat direkte optische Schnitte mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie war nur in der Lage, ein paar Zellschichten tief in Hefe-Kolonien zu erreichen. Diese Einschränkung ist aufgrund der starken Streuung des Lichts aus Hefezellen 4 wahrscheinlich. Hier präsentieren wir eine Methode zur Festsetzung und Kryoschneiden die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen in Saccharomyces cerevisiae Gemeinden zu basieren. Wir verwenden Methanol als Fixiermittelum die räumliche Verteilung der Zellen zu erhalten. Feste Gemeinden sind mit OCT-Verbindung, gefroren und kryogeschnitten in einem Kryostaten infiltriert. Fluoreszenz-Bildgebung der Abschnitte zeigt die interne Organisation der fluoreszierenden Zellen innerhalb der Gemeinschaft. Beispiele von Hefe Communities bestehend aus Stämmen exprimierenden rot und grün fluoreszierende Proteine ​​zeigen die Potentiale des Kryoschneiden Methode, um die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen sowie die der Genexpression innerhalb Hefekolonien 2,3 offenbaren. Obwohl unsere Fokussierung auf Saccharomyces cerevisiae Gemeinden gewesen ist, kann das gleiche Verfahren angewandt potentiell zu anderen mikrobiellen untersuchen.

Fluoreszenzbilder von vertikalen Querschnitten von Hefe Communities enthaltenden roten und grün-tagged wettbewerbsfähigen Populationen 6 sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Gemeinschaften bestehen aus zwei prototrophen Hefestämme und deren Wettbewerb für gemeinsam genutzte Ressourcen, einschließlich Raum, führt zu säulenartigen Strukturen 7, wie in ihrer vertikalen Querschnitten dargestellt. Auflösungen bis hinunter zu einer einzigen Zelle kann in Querschnitten gelöst w...

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Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Wir präsentieren ein Protokoll zum Einfrieren und Kryoschneiden Hefe Gemeinden internen Muster der fluoreszierenden Zellen zu beobachten. Die Methode beruht auf Methanol-Fixierung und OCT-Einbettung, um die räumliche Verteilung der Zellen ohne Inaktivierung fluoreszierende Proteine ​​innerhalb einer Gemeinschaft bewahren.

Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flash-Freezing und Kryoschneiden E12.5 Gehirn der Maus

Forschung

Biologie

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Mikrobielle Gemeinschaften in Natur und Labor - Interview

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie mikrobieller Gemeinschaften - Interview

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

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Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...