Name: cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00
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Vorremmo ringraziare Jonathan Cooper Lab Research Fred Hutchinson Cancer Centro per il permesso di usare il loro criostato. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH e il WM Keck Foundation. BM è un collega Gordon and Betty Moore Foundation di Life Science Research. Siamo grati a Daniel Gottschling per aver condiviso il suo protocollo di fissaggio con noi.

1. Fissaggio Comunità lievito <ol><li> Crescono comunità lievito su un filtro a membrana (ad esempio, Millipore MF membrana filtrante; Figura 2A). Questo protocollo corrisponde ad una tipica comunità inferiore a 2x10 8 celle di un millimetro di diametro 6 filtro a membrana. </li><li> Utilizzare un pezzo di carta da filtro Whatman 541 per coprire il fondo di un diametro di 1 cm-ben (Figura 2B). Questa carta Whatman sarà utilizzato come vettore per trasferire la ...

<ol>
	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

La procedura qui presentata offre un modo per controllare la struttura interna delle comunità lievito. La fase di fissaggio metanolo rende la colonia di lievito rigido 8 e preserva l&#39;integrità della colonia, tuttavia, causa anche restringimento 8 che deve essere preso in considerazione nell&#39;interpretazione dei risultati. Noi di solito vedere circa il 30% in altezza ritiro delle colonie di lievito, rispetto alle colonie direttamente incorporati nei PTOM senza fissare 9. <p c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 100% Metanolo </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek ottobre Compound </td><td> E vinci la scientifica </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grade Paper No. 541 filtro quantitativa </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore MF-filtro a membrana </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

I microbi in genere vivono in comunità. L&#39;organizzazione spaziale delle cellule all&#39;interno di una comunità si crede di influenzare la sopravvivenza e la funzione della comunità 1. Tecniche ottiche di sezionamento, tra cui la microscopia confocale e due fotoni, si sono dimostrati utili per osservare l&#39;organizzazione spaziale delle comunità batteriche e archaeal 2,3. Una combinazione di imaging confocale e sezionamento fisico di colonie di lievito ha rivelato organizzazione interna delle cellule 4. Tuttavia, diretto sezionamento ottico usando la microscopia confocale a due fotoni o è stato solo in grado di raggiungere un paio di strati di cellule in profondità in colonie di lievito. Questa limitazione è probabilmente a causa della dispersione di luce intensa da cellule di lievito 4. Qui vi presentiamo un metodo basato sulla determinazione e criosezionamento per ottenere la distribuzione spaziale delle cellule fluorescenti all&#39;interno delle comunità di Saccharomyces cerevisiae. Usiamo metanolo come agente fissativoda mantenere la distribuzione spaziale delle cellule. Comunità fissi sono infiltrati con OCT, congelati, e cryosectioned in un criostato. Imaging di fluorescenza delle sezioni rivela come l&#39;organizzazione interna delle cellule fluorescenti all&#39;interno della comunità. Esempi di comunità costituite ceppi di lievito che esprimono proteine ​​fluorescenti rosse e verdi dimostrare le potenzialità del metodo criosezionamento per rivelare la distribuzione spaziale delle cellule fluorescenti così come quella di espressione genica all&#39;interno colonie di lievito 2,3. Anche se la nostra attenzione si è concentrata sulle comunità di Saccharomyces cerevisiae, lo stesso metodo può potenzialmente essere applicato a esaminare altre comunità microbiche.

Immagini di fluorescenza di sezioni verticali delle comunità lievito contenenti rosso o verde etichettato popolazioni competitivi 6 sono mostrati nella Figura 3. Queste comunità sono costituiti da due ceppi di lievito e prototrofici loro competizione per risorse condivise, incluso lo spazio, porta a colonnare modelli 7, come mostrato nelle sezioni verticali. Risoluzioni fino a una singola cellula può essere risolto in sezioni. Figura 3 confronta sezioni delle co...

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Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Vi presentiamo un protocollo per congelare e criosezionamento comunità di lievito per osservare i modelli interni di cellule fluorescenti. Il metodo si basa su di fissaggio e metanolo-OCT-incorporamento per preservare la distribuzione spaziale di celle senza inattivare proteine ​​fluorescenti all&#39;interno di una comunità.

Criosezionamento Comunità di lievito per l&#39;esame di pattern di fluorescenza

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Research

JoVE Journal

Biology

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