Name: cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Jonathan Cooper Lab ved Fred Hutchinson Cancer Research Center for tillatelse til å bruke deres kryostaten. Dette arbeidet ble støttet av NIH og WM Keck Foundation. BM er en Gordon og Betty Moore stipendiat of Life Science Research Foundation. Vi er takknemlige for Daniel Gottschling for å dele sin festing protokollen med oss.

1. Fixing Gjær Communities <ol><li> Grow gjær samfunn på et membranfilter (f.eks Millipore MF membranfilter, figur 2A). Denne protokollen tilsvarer en typisk fellesskap av mindre enn 2x10 8 celler i et 6 mm-diameter membranfilter. </li><li> Bruk et stykke Whatman 541 filterpapir til å dekke bunnen av en 1 cm diameter brønn (figur 2B). Dette Whatman papir vil bli brukt som en bærer for å overføre fellesskapet i senere faser. Tilsett 1 ml 100% metanol til br?...

<ol>
	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

Prosedyren som presenteres her tilbyr en måte å inspisere den interne strukturen av gjær lokalsamfunn. Metanolen fikse trinnet gjør gjær kolonien stive 8 og bevarer integriteten av kolonien, men det fører også til krymping 8 som bør tas hensyn til i å tolke resultatene. Vi vanligvis ser rundt 30% svinn i høyden av gjær kolonier, sammenlignet med kolonier direkte innebygd i OCT uten å rette 9. For å unngå svinn, er en alternativ tilnærming for c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> 100% Metanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek oktober Compound </td><td> Andwin Scientific </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grade No 541 Kvantitativ Filter Paper </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF membranfilter </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

Mikrober vanligvis lever i lokalsamfunn. Den romlige organisering av celler innenfor et fellesskap antas å påvirke overlevelse og funksjon av fellesskap 1. Optiske seksjonering teknikker, inkludert confocal og to-foton mikroskopi, har vist seg nyttig for å observere romlige organiseringen av bakterie-og archaeal samfunn 2,3. En kombinasjon av confocal avbildning og fysisk seksjonering av gjær kolonier har avdekket interne organiseringen av celler 4. Imidlertid har direkte optisk seksjonering hjelp confocal eller to-foton mikroskopi vært bare i stand til å nå et par cellelagene dypt inn gjær koloniene. Denne begrensningen er sannsynlig på grunn av sterk spredning av lys fra gjærceller 4. Her presenterer vi en metode basert på å fikse og cryosectioning å få romlige fordelingen av fluorescerende celler innenfor Saccharomyces cerevisiae lokalsamfunn. Vi bruker metanol som fiksativ middelå bevare den romlige fordelingen av celler. Faste samfunn er infiltrert med oktober sammensatte, frossen, og cryosectioned i en kryostaten. Fluorescens avbildning av seksjonene avslører den interne organiseringen av fluorescerende celler i samfunnet. Eksempler på gjær samfunn bestående av stammer som uttrykker røde og grønne fluorescerende proteiner demonstrere mulighetene til cryosectioning metode for å avsløre den romlige fordelingen av fluorescerende celler samt at av genuttrykk i gjær koloniene 2,3. Selv om vårt fokus har vært på Saccharomyces cerevisiae lokalsamfunn, kan samme metode potensielt brukes til å undersøke andre mikrobielle samfunn.

Fluorescens bilder av vertikale tverrsnitt av gjær lokalsamfunn inneholdende rød-og grønn-tagget konkurransedyktige populasjoner 6 er vist i figur 3. Disse gruppene består av to prototrofe stammer av gjær og deres konkurranse for delte ressurser, inkludert plass, fører til søyleformede 7 mønstre, som vist i deres vertikale tverrsnitt. Oppløsninger ned til en enkelt celle kan løses i tverrsnitt. Figur 3 sammenligner tverrsnitt av gjentatte samfunn oppnådd...

Watch this Scientific Journal Video about Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns at JoVE.com

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Vi presenterer en protokoll for frysing og cryosectioning gjær samfunn for å observere interne mønstre av fluorescerende celler. Metoden baserer seg på metanol-innfesting og OCT-innebygging for å bevare den romlige fordelingen av celler uten å inaktivere fluorescerende proteiner i et fellesskap.

Cryosectioning Gjær Communities for å undersøke Fluorescens Patterns

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Biology of Microbial Communities  - Interview

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering for å oppdage Diverse Gene Expression Mønstre i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...