Name: simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Ce travail a été financé en partie par le CSIC (I + D projet C022) et PEDECIBA. Les auteurs tiennent à remercier Mariela Bollati et Valentina Porro de l&#39;Unité de biologie cellulaire (Institut Pasteur de Montevideo) pour leur généreuse collaboration concernant le trieur de cellules MoFlo, et Merial-Montevideo pour fournir doucement tous les échantillons de cobayes utilisés dans ce projet. Figure 1 a été reproduit avec l&#39;autorisation de BioMed Central, figures 2 et 3, et le tableau 1 avec la permission de S. Karger AG, Bâle, et les figures 4 et 5 ont été reproduits ou adaptés avec la permission de John Wiley &amp; Sons, Inc (copyright détenu par Wiley- Blackwell, 2011).

1. Préparation des suspensions cellulaires <ol><li> Sacrifiez le spécimen à être utilisés suivant les recommandations des comités spécialisés tels que IACUC ou équivalent (en Uruguay, Commission nationale pour l&#39;expérimentation animale [CNEA]). Dans notre cas, une surdose de pentobarbital a été administré. </li><li> Disséquer les testicules en suivant les procédures normales approuvées et les placer dans un verre 96 mm boîte de Pétri sur la glace, contenant 10 ml de DMEM glacée complété avec 1...

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

La méthode décrite ici optimisé permet la préparation de suspensions de cellules de rongeurs tissu testiculaire d&#39;une manière très rapide et reproductible, en évitant un traitement enzymatique et de détergent et de maintenir une bonne intégrité cellulaire et les proportions de types. La brièveté de la procédure (la durée de 15 minutes comprend dissection des testicules, la découpe des tissus, et la transformation), manipulations nécessaires sont minimales, et l&#39;absence de traitements enzymatiques...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

Testicules de mammifères sont des organes très complexes qui contiennent plus de 30 différents types de cellules, notamment les cellules testiculaires somatiques et les différentes étapes de cellules germinales. Cette hétérogénéité est un inconvénient majeur en ce qui concerne l&#39;étude des bases de la spermatogenèse chez les mammifères, comme les populations de cellules pures ou enrichies dans certaines étapes du développement des spermatozoïdes sont nécessaires pour la plupart des analyses moléculaires 1. Diverses stratégies telles que Staput 2,3, élutriation centrifuge 1, et cytométrie de flux (FC) 4,5 ont été utilisées pour obtenir des populations de cellules testiculaires enrichi ou purifié afin de permettre des études d&#39;expression différentielle de gènes. Il est nécessaire que les cellules sont en suspension de la plupart des approches d&#39;enrichissement / purification. Idéalement, la suspension cellulaire sera représentatif du tissu d&#39;origine, une forte proportion de cellules viables et peu multinucleates - qui ont tendance à se former en raison de lasyncytial nature de l&#39;épithélium séminifère 6,7 - et amas de cellules manquent de 1. Les rapports précédents ont mis en évidence que des suspensions de cellules testiculaires préparés par un procédé exclusivement mécanique agglutinées plus facilement que ceux trypsinisés 1. D&#39;autre part, les traitements enzymatiques avec RNAses et / ou des enzymes désagrégation comme la trypsine et la collagénase conduit à la dégradation des macromolécules spécifique, ce qui n&#39;est pas souhaitable pour certaines applications en aval. Le processus idéal doit être aussi courte que possible et impliquer une manipulation minimale, afin de parvenir à une bonne conservation des macromolécules d&#39;intérêt tels que les ARNm. Les protocoles actuels pour la préparation des suspensions cellulaires de tissus solides sont généralement beaucoup de temps, très dépendante de l&#39;opérateur, et peut endommager de façon sélective certains types de cellules 1,8. Le protocole présenté ici combine les avantages d&#39;une ventilation mécanique hautement reproductible et extrêmement brève avec l&#39;unBSENCE de traitement enzymatique, ce qui conduit à des suspensions cellulaires de bonne qualité qui peuvent être utilisés pour l&#39;analyse de cytométrie de flux et tri 4, et les études d&#39;expression génique pensées 9.

Un exemple d&#39;une suspension de cellules bien ventilées à partir de testicules de rats préparés avec le protocole décrit ici est illustré à la figure 1. En comparaison avec les traitements enzymatiques 6,8 et à des méthodes de désagrégation mécanique décrit précédemment 2, celui présenté ici est beaucoup plus rapide, nécessite moins de manipulation, est facilement reproductible (non opérateur-dépendant), et rend les débris de cel...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Un nouveau protocole pour la préparation mécanique des suspensions de cellules testiculaires de matériel de rongeurs, en évitant les enzymes et les détergents, est décrite. La méthode est très simple, rapide et reproductible, et rend les suspensions cellulaires de bonne qualité, qui sont adaptés pour le tri de flux et extraction de l&#39;ARN.

Technique simple et efficace pour la préparation de suspensions de cellules testiculaires

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Recherche

Biologie

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Préparation standardisée des suspensions unicellulaires provenant de tissus pulmonaires de la souris en utilisant les dissociateur gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Génération d&#39;une seule cellule suspensions de tissus de souris de neurones

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Préparation du Pooled lysat plaquettaire humain (pHPL) comme un supplément efficace pour animaux sans sérum humain cultures de cellules souches

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Préparation de la qualité de pyrophosphates inositol

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Mesure du pH vacuolaire et cytosolique<em&gt; In Vivo</em&gt; En cellule de levure Suspensions

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Procédé de préparation de lame pour préserver l’architecture de chromatine tridimensionnelle de cellules germinales testiculaires

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...