Name: simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise durch CSIC (I + D Projekt C022) und PEDECIBA unterstützt. Die Autoren wollen Mariela Bollati und Valentina Porro aus der Zellbiologie Unit (Institut Pasteur de Montevideo) danken für die großzügige Zusammenarbeit über die MoFlo Zellsortierer und Merial-Montevideo für sanft bietet alle Meerschweinchen Proben in diesem Projekt verwendet. Abbildung 1 Abbildungen 2 und 3 und Tabelle 1 mit Genehmigung der S. Karger AG, Basel;; wurde mit freundlicher Genehmigung von BioMed Central reproduziert und die Abbildungen 4 und 5 wurden reproduziert oder mit Genehmigung von John Wiley &amp; Sons, Inc. (Copyright im Besitz angepasst Wiley- Blackwell, 2011).

1. Herstellung von Zellsuspensionen <ol><li> Sacrifice die Probe entsprechend den Empfehlungen der Fachausschüsse wie IACUC oder gleichwertig verwendet werden (in Uruguay, Nationale Kommission für Tierversuche [CNEA]). In unserem Fall wurde eine Überdosis Pentobarbital verabreicht. </li><li> Präparieren Sie die Hoden nach der Norm zulässigen Verfahren und legen Sie sie in einem 96 mm Glas Petrischale auf Eis, mit 10 ml eiskaltem DMEM ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum. </li><li> Entfernen Sie die Tunica albug...

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

Die optimierte hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung von Zellsuspensionen aus Nagetier Hodengewebe in einem sehr schnellen und reproduzierbaren Weise vermeiden Enzym und Reinigungsmittel Behandlung und das Beibehalten der guten Integrität der Zelle und Art Proportionen. Die Kürze des Verfahrens (die 15 min Spannweite umfasst Hoden Dissektion, Schneiden von Gewebe und Verarbeitung), Aufwand ist minimal, und das Fehlen von enzymatischen Behandlungen sind nur einige der wichtigsten Vorteile. All dies w?...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

Mammalian Hoden sehr komplexe Organe, die mehr als 30 verschiedenen Zelltypen, einschließlich somatischen Zellen und Hoden verschiedenen Stadien der Keimbahn-Zellen enthalten. Diese Heterogenität ist ein wichtiger Nachteil bezüglich der Studie von den Basen der Säuger Spermatogenese, als reiner oder angereicherter Zellpopulationen in bestimmten Stadien der Entwicklung der Spermien für die meisten molekularen Analysen 1 benötigt. Verschiedene Strategien wie Staput 2,3, zentrifugale Elutriation 1 und Durchflusszytometrie (FC) 4,5 wurden eingesetzt, um angereichert oder gereinigt Hoden Zellpopulationen zu erhalten, um differentiellen Genexpression Studien zu ermöglichen. Es ist erforderlich, dass die Zellen in Suspension für die meisten Anreicherung / Reinigung möglich sind. Im Idealfall wird die Zellsuspension werden Vertreter des ursprünglichen Gewebes, haben einen hohen Anteil an lebensfähigen Zellen und nur wenige multinucleates - die dazu neigen, wegen der Form,Syncytial Natur des Samenepithels 6,7 - und der Mangel Zellklumpen 1. Frühere Berichte hatten bewiesen, dass Hoden Zellsuspensionen von einem ausschließlich mechanischen Verfahren hergestellt leichter verklumpt als diejenigen trypsinierten 1. Auf der anderen Seite, enzymatische Behandlungen mit RNasen und / oder Disaggregation Enzyme wie Trypsin und Collagenase führen zu Makromolekülen Abbau, was für die bestimmten Downstream-Anwendungen ist. Der ideale Prozess sollte so kurz wie möglich und beinhalten minimale Manipulation, um so eine gute Erhaltung der Makromoleküle von Interesse, wie mRNAs zu erreichen. Diese Protokolle zur Herstellung von Zellsuspensionen aus festen Geweben sind in der Regel zeitaufwendig, sehr bedienerabhängige und wahlweise beschädigen bestimmten Zelltypen 1,8. Das Protokoll hier vereint die Vorteile einer hoch reproduzierbar und extrem kurzen mechanischen Aufschluss mit dem einbsence der enzymatischen Behandlung, was eine gute Qualität Zellsuspensionen, die für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung 4 und anderweitige Genexpressionsstudien 9 verwendet werden kann.

Ein Beispiel für ein gut aufgeschlüsselten Zellsuspension aus Rattenhoden mit dem hier beschriebenen Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Vergleich zur enzymatischen Behandlungen 6,8 und den zuvor beschriebenen mechanischen Aufschluss Verfahren 2 ist die hier vorgestellte viel schneller beinhaltet weniger Handhabung ist leicht reproduzierbar (nicht bedienerabhängige) und macht knapp Zelltrümmer (insbesondere im Vergleich zu anderen mechanisc...

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Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Forschung

Biologie

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Vorbereitung der gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) als effiziente Ergänzung zum tierischen Serum-freien menschlichen Stammzell-Kulturen

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Erstellung von Qualitäts-Inositol Pyrophosphate

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Messung von pH Vacuolar und Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In Hefe Zellsuspensionen

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...