Name: simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי CSIC (אני + D פרויקט C022) וPEDECIBA. המחברים מבקשים להודות לMariela Bollati ולנטינה Porro מיחידת הביולוגיה של התא (המכון פסטר דה מונטבידאו) לשיתוף הפעולה הנדיב שלהם בנוגע לסדרן תא MoFlo, וMerial-מונטווידאו לעדינות מספק את כל הדגימות שרקנו המשמשות בפרויקט זה. איור 1 שוחזר באישור ביומד המרכזי; איורים 2 ו -3, ולוח 1 באישורו של ס &#39;Karger AG, באזל, ואיורים 4 ו -5 היו לשכפל או מותאמים באישור של John Wiley &amp; Sons, Inc (זכויות יוצרים שבבעלות Wiley- בלקוול, 2011).

1. הכנת השעיות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את הדגימה לשימוש בעקבות ההמלצות של הוועדות המיוחדות כגון IACUC (או שווה ערך באורוגוואי, הוועדה הלאומית לניסויים בבעלי החיים [CNEA]). במקרה שלנו, ממנת יתר של pentobarbital היה מנוהל. </li><li style=";text-align:right;direction:r...

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת הכנה של השעיות תא מרקמת אשך מכרסם בדרך מהירה ולשעתק מאוד, הימנעות מטיפול אנזים וחומר ניקוי ושמירה על שלמות תא טובה ופרופורציות סוג. קיצורו של הנוהל (תוחלת 15 דקות כוללת נתיחת אשך, חיתוך רקמות, ועיבוד), הטיפול מינימאלי המעורבים, והיעד...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

אשכים יונקים הם איברים מורכבים מאוד המכילים יותר מ -30 סוגי תאים שונים, כוללים תאים הסומטיים אשכים ושלבים של תאי germline שונים. ההטרוגניות הזאת היא חסרון מהותי הנוגע למחקר מהבסיסים של spermatogenesis יונקים, כפי שאוכלוסיות תאים טהורות או מועשרת בשלבים מסוימים של התפתחות זרע יש צורך ברוב הניתוחים מולקולריים 1. אסטרטגיות שונות כגון 2,3 Staput, elutriation צנטריפוגלי 1, וcytometry הזרימה (FC) 4,5 להיות מועסקת להשיג אוכלוסיות תאי אשכים מועשרים או מטוהרים על מנת לאפשר ביטוי במחקרי גן דיפרנציאלי. נדרש כי תאים בתרחיף עבור רוב ההעשרה / טיהור גישות. באופן אידיאלי, את ההשעיה התא תהיה נציג של הרקמה המקורית, יש שיעור גבוה של תאי קיימא וכמה multinucleates - שנוטים להיווצר בגללטבע סינסיציאלי של האפיתל seminiferous 6,7 - וגושי תאי חוסר 1. דיווחים קודמים שמעידים כי השעיות תא אשכים שהוכנו על ידי שיטה מכאנית באופן בלעדי בכבדות בקלות רבה יותר מאשר אלה trypsinized 1. מצד השני, טיפולים אנזימטיים עם RNases ו / או אנזימי ריסוק כמו טריפסין וcollagenase להוביל לפירוק מולקולות ספציפי, אשר אינו רצוי עבור יישומים במורד הזרם מסוימים. התהליך האידיאלי צריך להיות קצר ככל האפשר, וכרוך במניפולציה מינימאלית, כדי להשיג שימור טוב של מולקולות של עניין, כגון mRNAs. פרוטוקולים הנוכחיים להכנת תאים מרקמות מוצקות מתלים הם בדרך כלל זמן רב, מאוד תלויים במפעיל, ועלולים לפגוע באופן סלקטיבי תאים מסוגים מסוימים 1,8. הפרוטוקול המובא כאן משלב את היתרונות של disaggregation מכאני לשעתקו מאוד וקצר מאוד עםbsence האנזימטית של טיפול, מה שמוביל להשעיות תא באיכות טובות, שניתן להשתמש בם לניתוח תזרים cytometric ומיון 4, ומחקרי ביטוי גנים נסתרים 9.

דוגמה של השעיה תא היטב פירוט רחב מאשכי עכברים שהוכנו עם הפרוטוקול המתואר כאן מוצגת באיור 1. בהשוואה לטיפולים אנזימטיות 6,8 ולשיטות שתוארו לעיל disaggregation מכאניים 2, אחד המוצג כאן הוא הרבה יותר מהר, כרוך בפחות טיפו?...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

פרוטוקול חדש להכנה מכאנית של השעיות אשכים סלולריים מחומר מכרסם, הימנעות אנזימים וחומרי ניקוי, מתואר. השיטה היא מאוד פשוטה, מהירה, לשחזור, והופכת השעיות תא באיכות טובות, אשר מתאימות למיון זרימה ומיצוי RNA.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

מדידה של pH vacuolar וCytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; בהשעיות תא שמרים

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...