Name: simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

本研究の一部はCSIC（I + DプロジェクトC022）とPEDECI​​BAによってサポートされていました。著者は優しく、このプロジェクトで使用されているすべてのモルモット標本を提供するために細胞生物学MoFloのセルソーターに関する彼らの寛大なコラボレーションのためのユニット（パスツール研究所デモンテビデオ）、およびメリアル·モンテビデオからマリエラBollatiとヴァレンティナポロに感謝したいと思います。 図1図2と図3、およびS. KargerのAG、バーゼルの許可を得て、表1;; BioMedの中央の許可を得て再現しましたし、 図4と図5は、ジョン·ワイリー＆サンズ株式会社（が所有する著作権の許可を得て複製したり、適応したワイリーブラックウェル、2011）。

1。細胞懸濁液の調製<ol><li>このような動物実験委員会または同等の専門委員会の勧告後に使用する試験片を生け贄に捧げる（ウルグアイ、国家委員会における動物実験のための[CNEA]）。我々のケースでは、ペントバルビタールの過剰摂取は、投与した。 </li><li>標準的な承認さ​​れた手順に従って、精巣を解剖し、氷冷DMEM、10 mlを入れ、氷の上に96ミリメートルのガラスペトリ皿に配置し?...

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

ここで説明する最適化された方法は、酵素と界面活性剤処理を回避し、良好な細胞の完全性と型の比率を維持し、非常に高速かつ再現可能な方法で、げっ歯類の精巣組織からの細胞懸濁液の調製を可能にする。手順（15分スパンが精巣解剖、組織の切断、および処理が含まれます）、関係する最小限の処理、酵素処理の不在の簡潔さは、主な利点のいくつかである。これらはすべて、元の細?...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

哺乳動物の精巣は、体精巣細胞と生殖細胞のさまざまな段階を含む、30以上の異なる種類の細胞が含まれている非常に複雑な器官である。精子開発の特定の段階で純粋なまたは濃縮された細胞集団は最も分子解析1のために必要とされるので、この不均一性は、哺乳類の精子形成の拠点の研究に関する重要な欠点である。 例えばStaput 2,3、遠心水簸1、およびフローサイトメトリー（FC）4,5等の各種戦略が異なる遺伝子発現研究を可能にするために、富化または精製された精巣細胞集団を得るために用いられてきた。 これは、細胞が最も濃縮/精製アプローチが懸濁液であることが必要である。理想的には、細胞懸濁液は、元の組織の代表となり、生細胞と少数multinucleatesの高い割合を持っている - ために形成する傾向があると不足細胞塊1 -精上皮6,7の合胞体性質。以前の報告では、もっぱら機械的な方法によって調製精巣細胞懸濁液は、トリプシン処理したもの1よりも容易に凝集していることも明らかでした。 RNアーゼおよび/または特定のダウンストリームアプリケーションのために望ましくない特定の高分子の劣化へのトリプシン及びコラゲナーゼ鉛のように分解する酵素で、一方、酵素処理。理想的なプロセスは、mRNAのようなその他の巨大分子の良好な保存を達成するために、可能な限り短くし、最小限の操作を含むべきである。固形組織からの細胞懸濁液の調製のための現在のプロトコルは、通常、時間がかかり、非常にオペレータに依存しており、選択的に特定の細胞型1,8に損傷を与えることができる。 ここで紹介するプロトコルは、と再現性の高い、非常に簡単な機械的な分解の利点を兼ね備えていますフローサイトメトリー分析および選別4、及び不純な遺伝子発現研究9に用いることができる良質の細胞懸濁液につながる酵素処理のbsence。

ここで説明されたプロトコルを用いて調製したラット精巣からよく分解された細胞懸濁液の例は、図1に示されている。 酵素処理6,8へと前述した機械的な分解方法2と比較すると、ここで紹介する1（特に他の機械に比べて、はるかに高速です少ないハンドリングを伴う、（not演算子に依存）を簡単に再現可能であり、希少細胞の破片をレンダ?...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

gentleMACS Dissociatorを使用してマウスの肺組織からの単細胞懸濁液の標準化の準備

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

動物の無血清ヒト幹細胞培養のための効率的なサプリメントとしてプールしたヒト血小板可溶化物（pHPL）の調製

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

品質イノシトールピロリン酸塩の調製

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

液胞と細胞質のpHの測定<emインビボで&gt;</em&gt;酵母細胞懸濁液に

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...