Name: simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av CSIC (I + D prosjekt C022) og PEDECIBA. Forfatterne ønsker å takke Mariela Bollati og Valentina Porro fra Cell Biology Unit (Institut Pasteur de Montevideo) for deres generøse samarbeid om MoFlo celle sorter, og Merial-Montevideo for forsiktig gi alle marsvin prøver som brukes i dette prosjektet. Figur 1 ble gjengitt med tillatelse fra BioMed Central, figur 2 og 3, og tabell 1 med tillatelse fra S. Karger AG, Basel, og figur 4 og 5 ble gjengitt eller tilpasses med tillatelse fra John Wiley &amp; Sons, Inc (copyright eies av Wiley- Blackwell, 2011).

En. Utarbeidelse av cellesuspensjoner <ol><li> Ofre prøven som skal brukes følge anbefalingene fra de spesialiserte komiteer som IACUC eller tilsvarende (i Uruguay, National Commission for forsøk med dyr [CNEA]). I vårt tilfelle ble det en overdose av pentobarbital administreres. </li><li> Dissekere testiklene følgende standard godkjente prosedyrer og plassere dem i en 96 mm glass petriskål på is, som inneholder 10 ml iskald DMEM supplert med 10% kalvefosterserum. </li><li> Fjern hvite hinne og kutte decapsulat...

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

Den optimaliserte metoden beskrevet her gjør utarbeidelse av cellesuspensjoner fra gnager testikkelvev i en svært rask og reproduserbar måte, unngå enzym og vaskemiddel behandling og opprettholde god celle integritet og skriver proporsjoner. Den korte prosedyren (15 min span inkluderer testis disseksjon, vevsskjæring, og behandling), minimal håndtering involvert, og fravær av enzymatiske behandlinger er noen av de viktigste fordelene. Alle disse ville forklare den gode konservering av kort levetid makromolekyler,...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

Pattedyr testiklene er svært komplekse organer som inneholder over 30 forskjellige celletyper, inkludert somatiske testikkelceller og ulike stadier av kimlinje celler. Denne heterogenitet er en viktig ulempe når det gjelder studium av basene av spermatogenesen hos pattedyr, som rene eller anrikede cellepopulasjoner i visse stadier av utvikling av spermiene er nødvendig for de fleste molekylære analyser 1. Forskjellige strategier som 2,3 Staput, sentrifugal elutriation 1, og strømningscytometri (FC) 4,5 er anvendt for å oppnå anriket eller renset testikulære cellepopulasjoner for å muliggjøre differensiell genekspresjon studier. Det kreves at cellene er i suspensjon i de fleste berikelse / rensing tilnærminger. Ideelt sett vil cellesuspensjonen være representative for den opprinnelige vev, har en høy andel av levedyktige celler og noen multinucleates - som har en tendens til å danne grunn avsyncytiale natur seminiferous epitel 6,7 - og mangel celle klumper en. Tidligere rapporter hadde dokumentert at testiklene cellesuspensjoner utarbeidet av en utelukkende mekanisk metode klumpet seg lettere enn trypsinisert seg en. På den annen side, enzymatiske behandlinger med RNases og / eller disaggregating enzymer som trypsin og kollagenase fører til spesifikke makromolekyler degradering, noe som er uønsket for visse anvendelser nedstrøms. Den ideelle prosess skal være så kort som mulig, og involvere minimal manipulering, slik at man oppnår en god bevaring av makromolekyler av interesse, slik som mRNA. Nåværende protokoller for utarbeidelse av cellesuspensjoner fra solide vev er vanligvis tidkrevende, svært avhengig av operatør, og kan selektivt skade visse celletyper 1,8. Protokollen som presenteres her kombinerer fordelene med en meget reproduserbar og ekstremt kort mekanisk disaggregation med enbsence for enzymatisk behandling, som fører til god kvalitet cellesuspensjoner som kan brukes for flowcytometrisk analyse og sortering 4, og utenforliggende genekspresjon studier 9.

Et eksempel på en vel disaggregert cellesuspensjon fra rotte prøvene fremstilt med den protokoll som er beskrevet her, er vist i figur 1. I forhold til enzymatiske behandlinger 6,8 og med tidligere beskrevne mekaniske disaggregation metode 2, er den som presenteres her mye raskere, innebærer mindre håndtering, er lett reproduserbar (ikke avhenger av operatøren), og gjengir knappe celleavfall (spesielt i forhold til andre mekaniske metoder) og svær...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

En roman protokoll for den mekaniske utarbeidelse av testiklene cellesuspensjoner fra gnager materialet, unngå enzymer og vaskemidler, er beskrevet. Metoden er svært enkel, rask, reproduserbar, og gjengir god kvalitet cellesuspensjoner, som er egnet for flow sortering og RNA ekstraksjon.

Enkel og effektiv teknikk for utarbeidelse av testikkel cellesuspensjoner

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Måling av vacuolar og cytosolic pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I gjær cellesuspensjoner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration of Plants for High-level Forbigående Expression of rekombinante proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Skyv forberedelsesmetode for å bevare tredimensjonal kromatinarkitektur av testikkel bakterieceller

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Effektiv iPS Cell Generation fra Blood hjelp episomer og HDAC hemmere

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv pattedyrcelle Expression og Single-step Rensing av Ekstracellulær Glykoproteiner for Krystallisering

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...