Name: simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo CSIC (I + D projeto C022) e PEDECIBA. Os autores querem agradecer Mariela Bollati e Valentina Porro da Unidade de Biologia da Célula (Institut Pasteur de Montevidéu) pela colaboração generosa sobre o classificador de células MoFlo e Merial-Montevidéu por fornecer gentilmente todos os espécimes de cobaias utilizadas neste projeto. Figura 1 foi reproduzido com permissão do BioMed Central; Figuras 2 e 3, e na Tabela 1, com permissão de S. Karger AG, Basel e Figuras 4 e 5 foram reproduzidos ou adaptados com permissão de John Wiley &amp; Sons, Inc (direitos autorais de propriedade da Wiley- Blackwell, 2011).

1. Preparação de suspensões de células <ol><li> Sacrificar o espécime a ser utilizado seguindo as recomendações das comissões especializadas, como IACUC ou equivalente (no Uruguai, Comissão Nacional de Experimentação Animal [CNEA]). No nosso caso, uma dose excessiva de pentobarbital foi administrada. </li><li> Dissecar testículos seguindo procedimentos padrão aprovados e colocá-los num copo 96 milímetros de Petri em gelo, contendo 10 ml de DMEM gelada suplementada com soro de vitela fetal a 10%. </li><l...

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

O método descrito aqui optimizado permite a preparação de suspensões de células a partir de tecido testicular de roedores de um modo muito rápido e reprodutível, evitando o tratamento enzima e detergente e de manter uma boa integridade da célula e tipo proporções. A brevidade do procedimento (a 15 min extensão inclui dissecção testículo, corte de tecido, e transformação), envolva um mínimo de manipulação, e na ausência de tratamentos enzimáticos são algumas das principais vantagens. Todas estas rep...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

Testículos mamíferos são órgãos muito complexos que contêm mais de 30 diferentes tipos de células, incluindo as células testiculares somáticas e diferentes estágios de células germinativas. Esta heterogeneidade é uma desvantagem importante em relação ao estudo das bases da espermatogénese mamíferos, visto que são necessárias populações puras ou enriquecidas de células em determinadas fases do desenvolvimento do esperma para a maioria das análises moleculares 1. Várias estratégias, tais como Staput 2,3, uma elutriação centrífuga, e por citometria de fluxo (FC) de 4,5 foram utilizados para a obtenção de populações de células testiculares enriquecida ou purificada, a fim de permitir que os estudos de expressão diferencial de genes. Exige-se que as células estão em suspensão para a maioria das abordagens de enriquecimento / purificao. Idealmente, a suspensão de células seja representativo do tecido original, possuem uma elevada proporção de células viáveis ​​e alguns multinucleates - que tendem a formar por causa donatureza sincicial do epitélio seminífero 6,7 - e aglomerados de células falta um. Relatórios anteriores evidenciaram que as suspensões de células testiculares preparados por um método exclusivamente mecânica agregada mais facilmente do que os tripsinizados 1. Por outro lado, os tratamentos enzimáticos com ARNases e / ou desagregação das enzimas como a tripsina e a colagenase, levar à deterioração macromoléculas específicas, o que é indesejável em certas aplicações a jusante. O processo ideal deveria ser tão curto quanto possível e envolvem manipulação mínima de modo a conseguir uma boa conservação das macromoléculas de interesse, tal como ARNm. Protocolos actuais para a preparação de suspensões de células a partir de tecidos sólidos são geralmente demorados, altamente dependente do operador, e podem danificar selectivamente certos tipos de células 1,8. O protocolo aqui apresentado combina as vantagens de uma desagregação mecânica altamente reprodutível e extremamente breve com o umbsence de tratamento enzimático, que conduz a boas suspensões de células de qualidade que possam ser utilizados para a análise por citometria de fluxo e a triagem 4, e os estudos de expressão de genes posteriores 9.

Um exemplo de uma suspensão de células bem desagregada preparados a partir de testículos de ratos com o protocolo aqui descrito é mostrado na Figura 1. Em comparação com os tratamentos enzimáticos 6,8 a desagregação e a métodos mecânicos descritos anteriormente 2, o que foi apresentado aqui é muito mais rápido, envolve menos manuseamento, é facilmente reprodutível (não dependente do operador), os detritos celulares e torna escassa (espec...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Biologia

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Medição do valor pH vacuolar e Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; Em Suspensions célula de levedura

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...