Name: simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av CSIC (I + D projekt C022) och PEDECIBA. Författarna vill tacka Mariela Bollati och Valentina Porro från cellbiologi Unit (Institut Pasteur de Montevideo) för deras generösa samarbete rörande MoFlo cellsorteraren och Merial-Montevideo för försiktigt ge alla marsvin prover som används i detta projekt. Figur 1 var reproducerad med tillstånd av BioMed Central, fig 2 och 3, och tabell 1 med tillstånd av S. Karger AG, Basel, och figurerna 4 och 5 var reproduceras eller anpassats med tillstånd av John Wiley &amp; Sons, Inc. (copyright ägs av Wiley- Blackwell, 2011).

Ett. Framställning av cellsuspensioner <ol><li> Offra provet som skall användas i enlighet med rekommendationerna från de specialiserade utskotten såsom IACUC eller motsvarande (i Uruguay, Nationella kommissionen för djurförsöksnämnden [CNEA]). I vårt fall var en överdos av pentobarbital administreras. </li><li> Dissekera testiklarna följande standard godkända förfaranden och placera dem i en 96 mm glas petriskål på is, innehållande 10 ml iskall DMEM kompletterat med 10% kalvfosterserum. </li><li> Ta t...

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

Den optimerade här beskrivna metoden möjliggör framställning av cellsuspensioner från gnagare testikelvävnad på ett mycket snabbt och reproducerbart sätt som undviker enzym och detergentbehandling och bibehålla god cellernas integritet och proportioner typ. Den korta förfarandet (15 min span innehåller testiklarna dissektion, vävnad skärning och bearbetning), minimal hantering inblandade, och frånvaro av enzymatiska behandlingar är några av de viktigaste fördelarna. Alla dessa skulle stå för det goda ...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

Mammaliska testiklar är väldigt komplexa organ som innehåller över 30 olika celltyper, inklusive somatiska testikelceller och olika stadier av könsceller celler. Denna heterogenitet är en viktig nackdel om studiet av grunderna för däggdjur spermatogenes, som rena eller anrikade cellpopulationer i vissa skeden av spermier utveckling behövs för de flesta molekylära analyser 1. Olika strategier såsom Staput 2,3, centrifugal elutriation 1, och flödescytometri (FC) har 4,5 använts för att erhålla anrikade eller renade testikulära cellpopulationer för att möjliggöra differentierade genuttrycksstudier. Det krävs att cellerna är i suspension flesta anrikning / rening metoder. Helst ska cellsuspensionen vara representativa för den ursprungliga vävnaden, har en hög andel av livsdugliga celler och några multinucleates - som tenderar att bildas på grund av densyncytial karaktär av seminiferiepitel 6,7 - och saknar klumpar cell 1. Tidigare rapporter hade bevisat att testikel cellsuspensioner framställda genom en uteslutande mekanisk metod clumped lättare än trypsinerade ettor 1. Å andra sidan, enzymatiska behandlingar med RNAs och / eller disaggregerar enzymer såsom trypsin och kollagenas leder till specifika makromolekyler nedbrytning, vilket inte är önskvärt för vissa tillämpningar i efterföljande led. Den ideala processen ska vara så kort som möjligt och involvera minimal manipulation, för att uppnå ett gott bevarande av makromolekyler av intresse såsom mRNA. Nuvarande protokoll för framställning av cellsuspensioner från solida vävnader är oftast tidsödande, starkt operatörsberoende, och kan selektivt skada vissa celltyper 1,8. Protokollet presenteras här kombinerar fördelarna med en mycket reproducerbar och extremt korta mekanisk uppdelning med enbsence av enzymatisk behandling, vilket leder till god suspensioner kvalitet cell som kan användas för flödescytometrisk analys och sortering 4, och dolda gen studier uttryck 9.

Ett exempel på en väl uppdelad cellsuspension från råtta testiklar framställda med det protokoll som beskrivs här visas i figur 1. I jämförelse med enzymatiska behandlingar 6,8 och tidigare beskrivna mekaniska uppdelningsnivåer metoder 2, är det som presenteras här mycket snabbare, innebär mindre hantering, är lätt reproducerbar (ej operatörsberoende), och gör knappa cellsönderfall (särskilt jämfört med andra mekaniska metoder) och v...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions at JoVE.com

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Ett nytt protokoll för mekanisk framställning av testikelcancer cellsuspensioner från gnagare material, undvika enzymer och rengöringsmedel, beskrivs. Metoden är mycket enkel, snabb, reproducerbar, och gör goda suspensioner kvalitets celler, som är lämpliga för flöde sortering och RNA-extraktion.

Enkel och effektiv teknik för framställning av Testicular cellsuspensioner

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Beredning av encelliga Suspensioner från musmjälte med gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Standardiserade Beredning av encelliga Suspensioner från mus lungvävnad med gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generering av encelliga Suspensioner från mus nervvävnad

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Beredning av poolade humana trombocyter lysat (pHPL) som en effektiv Tillägg för Animal serumfritt mänskliga kulturer Stem Cell

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Beredning av kvalitet Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Mätning av vakuolär och cytosolisk pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I jästcell Suspensioner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration av växter för hög nivå Transient Expression av rekombinanta proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Bildberedningsmetod för att bevara tredimensionell kromatinarkitektur av testikelceller

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Effektiv iPS cell Generation från Blood Använda episomer och HDAC inhibitorer

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv Mammalian Cell Expression och Single-steg Rening av extracellulära glykoproteiner för kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...