Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

De auteurs willen graag Miss Liana Mackiewicz bedanken voor technische bijstand. Dit werk werd mogelijk gemaakt door Victoriaanse Overheid van de Staat Operationele Infrastructuur Support en Australische regering National Health en Medical Research Council IRIISS en Project Grant 1031212.

1. Infectie van muizen met P. berghei-ANKA <ol><li> Ontdooi een portie van gecryopreserveerde P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Juist remmen cerebrale malaria-resistente BALB / c donor muis (8-12 weken oud) met de twee handen beperking techniek. Injecteer muis met 100-200 pi PRBC met een 1 ml insulinespuit (28G naald). Routinematig, 1-2 donormuizen geïnjecteerd. </li><li> Op de dagen 4 tot 5 na infectie (pi) te verwijderen donor muis van kooi en plaats het op een werkstation of een wegwerp werkende pa...

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

De isolatie en analyse van BSL is een methode die karakterisering en kwantificering van inflammatoire cellen migreren naar de hersenen in reactie op weefselbeschadiging of infectie in experimentele muismodellen maakt. De invoering van een intracardiale perfusie stap voor het verwijderen van het bloedcompartiment voor orgaanextractie en latere celisolatie is nuttig om contaminatie van inflammatoire cellen met niet-inflammatoire circulerende leukocyten voorkomen. Dit is misschien niet een essentiële vereiste in neurotrop...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Oplossingen en buffers </td></tr><tr><td> Giemsa&#39;s azur eosine methyleenblauw-oplossing </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 1:10 verdunning in gedestilleerd water </td></tr><tr><td> RPMI medium </td><td></td><td></td><td> Muis tonus </td></tr><tr><td> Muis tonus PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM natriumfosfaat, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:2 verdunning </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Worthington Biochemical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Van runderpancreas </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% oplossing in PBS </td></tr><tr><td> Ultrapuur Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Chloride (NH4Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14 nm NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA dinatriumzout </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antilichamen en conjugaten </td></tr><tr><td> Anti-muis CD16/CD32 (Fc Block), kloon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ul in 50 ul buffer kleuring (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-muis CD4, kloon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-muis NK1.1, kloon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-muis CD8, kloon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-muis TCR-β, kloon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-muis CXCR3, clone 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Gebiotinyleerd-anti-muis CCR5, kloon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Apparatuur en materiaal </td></tr><tr><td> SuperFrost microscoopglaasje </td><td> Lomb Menzel-Glaser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection tang, schaar </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS reservoir </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rubber slangen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G naald </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Cell dissociatie kit met metalen zeef </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 pm nylon celzeef </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometrie buizen </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

We beschrijven een werkwijze voor isolatie en karakterisering van hechtende ontstekingscellen uit hersenen bloedvaten P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen. Infectie van gevoelige muizen-stammen met deze parasiet stam resulteert in de inductie van experimentele cerebrale malaria, een neurologisch syndroom dat recapituleert bepaalde belangrijke aspecten van Plasmodium falciparum-gemedieerde ernstige malaria in mensen 1,2. Rijpe vormen van bloed-stage malaria expressie parasitaire eiwitten op het oppervlak van de geïnfecteerde erythrocyten, waardoor ze binden aan vasculaire endotheelcellen. Dit proces leidt tot verstoppingen in de bloedstroom, wat resulteert in hypoxie en bloedingen 3 en stimuleert ook de werving van inflammatoire leukocyten naar de plaats van parasiet vastlegging. In tegenstelling tot andere infecties, zoals virussen neutrotopic 4-6, zowel malaria-geparasiteerde rode bloedcellen (PRBC) en geassocieerde InflammAtory leukocyten blijven afgezonderd binnen de bloedvaten in plaats van te infiltreren in de hersenen parenchym. Dus om contaminatie van afgezonderd leukocyten met niet-inflammatoire circulerende cellen, uitgebreide intracardiale perfusie van geïnfecteerde-muizen voorafgaand aan orgaanextractie en weefsel verwerking wordt verontreinigd is nodig in deze procedure om het bloed compartiment te verwijderen. Na perfusie, zijn hersenen geoogst en ontleed in kleine stukjes. De weefselstructuur wordt verder verstoord door enzymatische behandeling met collagenase en D DNAse I. De resulterende hersenhomogenaat wordt vervolgens gecentrifugeerd op een Percoll-gradiënt die scheiding van hersenen gesekwestreerde leukocyten (BSL) van myeline en andere weefselafval maakt. Geïsoleerde cellen worden vervolgens gewassen, geteld met een hemocytometer en gekleurd met fluorescente antilichamen voor verdere analyse door flowcytometrie. Deze procedure maakt uitgebreide fenotypische karakterisatie van inflammatoire leukocyten migreren naar de hersenen in rereactie op verschillende stimuli, waaronder beroerte alsook virale of parasitaire infecties. De werkwijze verschaft ook nuttig voor het beoordelen van nieuwe anti-inflammatoire behandelingen in preklinische diermodellen.

De resultaten in Fig. 2 tonen percentages en absolute aantallen van de verschillende BSL populaties hersteld van hersenen van geperfundeerde of unperfused malaria geïnfecteerde en naïef controle muizen. BSL geïsoleerd werden gekleurd met PE-anti-NK1.1 en APC-anti-TCR-β antilichamen zoals aangegeven in de tekst Protocol. Consistent met eerdere bevindingen 7-9, αβTCR + T-cellen bestaat een groot deel van de BSL pool in hersenen van geperfundeerde malaria geïnfecteerde muizen (dag 6 pi). Deze p...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen bloedvaten<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen beschreven. De werkwijze maakt kwantificering en fenotypische karakterisatie van leukocyten geïsoleerd na kleuring met fluorescente antilichamen en daaropvolgende analyse door flowcytometrie.

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Een experimenteel model om te studeren Tuberculose-Malaria Coinfection op Natuurlijke Transmissie van Mycobacterium tuberculosis En Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoieten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...