Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Mlle Liana Mackiewicz de l&#39;assistance technique. Ce travail a été rendu possible grâce au soutien du gouvernement l&#39;État de Victoria infrastructure opérationnelle et du gouvernement australien Santé nationale et du Conseil de recherches médicales IRIISS et de subvention de projet 1,031,212.

1. L&#39;infection des souris avec P. berghei ANKA- <ol><li> Décongeler une aliquote de cryoconservé P. berghei ANKA pRBC. </li><li> Retenir un paludisme cérébral résistant souris BALB / c donateurs (8-12 semaines d&#39;âge) en utilisant la technique de retenue à deux mains. Injecter la souris avec 100-200 ul de pRBC l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 ml d&#39;insuline (28G aiguille). Régulièrement, 1-2 souris donneuses sont injectés. </li><li> Sur les 4-5 jours post-infection (pi) retirer ...

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	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

L&#39;isolement et l&#39;analyse de BSL est une méthode qui permet la caractérisation et la quantification des cellules inflammatoires qui migrent vers le cerveau en réponse à une lésion tissulaire ou d&#39;une infection chez des souris modèles expérimentaux. L&#39;introduction d&#39;une étape de perfusion intracardiaque pour le retrait du compartiment sanguin avant l&#39;extraction d&#39;organes et de l&#39;isolement cellulaire ultérieur est utile pour prévenir la contamination de cellules inflammatoires avec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solutions et tampons </td></tr><tr><td> Giemsa azur éosine solution de bleu de méthylène </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Dilution 1:10 dans de l&#39;eau distillée </td></tr><tr><td> Milieu RPMI </td><td></td><td></td><td> Souris tonicité </td></tr><tr><td> Souris tonicité PBS </td><td></td><td></td><td> Phosphate de sodium 20 mM, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% bleu trypan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> Dilution 1:2 </td></tr><tr><td> Collagénase D </td><td> Biochimique Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DeoxyribonuClease (DNAse) Je </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> À partir de pancréas de bovin </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> Solution à 30% dans du PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure d&#39;ammonium (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Rouge tampon de lyse cellulaire </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nm NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> Sel disodique d&#39;EDTA </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Les anticorps et les conjugués d&#39; </td></tr><tr><td> Anti-souris CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 pl dans 50 ul de tampon de coloration (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC anti-souris CD4, clone H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-souris NK1.1, clone PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 anti-souris CD8, clone 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC anti-souris TCR-β, clone H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-souris CXCR3, clone 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé anti-souris CCR5, clone C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement et matériel </td></tr><tr><td> Lame de microscope SuperFrost </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinces à dissection, ciseaux </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml de PBS réservoir </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tube en caoutchouc </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 23G </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de dissociation cellulaire contenant un métal tamis </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um filtre cellulaire en nylon </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> Neubauer GmbH </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de cytométrie en flux </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement et la caractérisation des cellules adhérentes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de P. berghei ANKA-souris infectées. L&#39;infection des souris sensibles avec les souches cela se traduit souche de parasite dans l&#39;induction de la malaria cérébrale expérimentale, un syndrome neurologique qui récapitule certains aspects importants de Plasmodium falciparum à médiation paludisme grave chez les humains 1,2. Formes matures du sang étapes paludisme exprimer des protéines parasites sur la surface de l&#39;érythrocyte infecté, ce qui leur permet de se lier à des cellules endothéliales vasculaires. Ce processus induit obstruction du flux sanguin, ce qui entraîne une hypoxie et des hémorragies 3 et stimule également le recrutement des leucocytes inflammatoires au site de la séquestration du parasite. Contrairement à d&#39;autres infections, à savoir les virus neutrotopic 4-6, les deux paludisme globules rouges parasités (pRBC) ainsi que associé Inflammleucocytes Atory reste séquestré dans les vaisseaux sanguins plutôt que de s&#39;infiltrer dans le parenchyme cérébral. Ainsi, pour éviter la contamination des leucocytes séquestrés avec des non-inflammatoires des cellules circulantes, vaste perfusion intracardiaque de souris infectées par-avant prélèvement d&#39;organes et de traitement des tissus est nécessaire dans cette procédure pour retirer le compartiment sanguin. Après la perfusion, les cerveaux sont prélevés et disséqués en petits morceaux. La structure du tissu est encore perturbée par un traitement enzymatique avec de la collagénase D et DNAse I. L&#39;homogénat de cerveau résultant est ensuite centrifugé sur un gradient Percoll qui permet de séparer le cerveau séquestrés leucocytes (BSL) de la myéline et des débris d&#39;autres tissus. Les cellules isolées sont ensuite lavées, comptées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et colorées avec des anticorps fluorescents pour une analyse ultérieure par cytométrie en flux. Cette procédure permet la caractérisation phénotypique complète des leucocytes inflammatoires de migrer vers le cerveau reréponse à divers stimuli, y compris les accidents vasculaires cérébraux ainsi que les infections virales ou parasitaires. La méthode fournit également un outil utile pour l&#39;évaluation de nouveaux traitements anti-inflammatoires dans des modèles animaux précliniques.

Les résultats de la Fig. 2 pourcentages montrent et le nombre absolu des différentes populations BSL récupérés à partir de cerveaux de souris perfusés ou unperfused contrôle infectées par la malaria et naïf. Isolé BSL ont été colorés avec du PE-anti-NK1.1 et APC-anti-TCR-β anticorps comme indiqué dans le texte du Protocole. Conformément aux conclusions précédentes 7-9, αβTCR cellules T comprend une forte proportion de la piscine BSL dans le cerveau des perfusés infectés par l...

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Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Une méthode pour l&#39;isolement des adhérents leucocytes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées est décrite. La méthode permet la quantification ainsi que la caractérisation phénotypique des leucocytes isolés après coloration avec des anticorps fluorescents et leur analyse ultérieure par cytométrie en flux.

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

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