Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Frau Liana Mackiewicz für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Victorian State Government Operational Support der Infrastruktur und der australischen Regierung National Health and Medical Research Council IRIISS und Project Grant 1031212.

Ein. Infektion von Mäusen mit P. berghei-ANKA <ol><li> Defrost ein Aliquot von kryokonservierten P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Restrain eine zerebrale Malaria-resistente BALB / c Donor-Maus (8-12 Wochen alt) mit dem two-handed Zurückhaltung Technik. Inject Maus mit 100-200 ul PRBC mit einer 1 ml Insulinspritze (28G Nadel). Routinemäßig werden 1-2 Spender-Mäusen injiziert. </li><li> Am Tag 4-5 nach der Infektion (pi) zu entfernen Donor-Maus aus dem Käfig und legen Sie sie auf einer Workstation...

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	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

Die Isolierung und Analyse der BSL ist eine Methode, Charakterisierung und Quantifizierung von Entzündungszellen die Migration auf das Gehirn als Reaktion auf Gewebeverletzung oder Infektion in experimentellen Mausmodellen können. Die Einführung eines intrakardialen Perfusion Schritt zur Entfernung des Organs Blutabteil vor Extraktion und anschließende Zellisolation ist nützlich, um eine Kontamination von entzündlichen Zellen mit nicht-entzündliche zirkulierenden Leukozyten zu verhindern. Dies könnte nicht eine ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösungen und Puffer </td></tr><tr><td> Giemsas azur Eosin-Methylenblau-Lösung </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 1:10-Verdünnung in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> RPMI-Medium </td><td></td><td></td><td> Maus Tonus </td></tr><tr><td> Maus Tonus PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM Natriumphosphat, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypanblau </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:2 Verdünnung </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Worthington Biochemical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DeoxyribonuClease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Von Rinderpankreas </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% ige Lösung in PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumchlorid (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14Nm NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA Dinatriumsalz </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikörper und Konjugate </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD16/CD32 (Fc Block), Klon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ul in 50 ul Färbepuffer (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-Maus-CD4, Klon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-Maus-NK1.1, Klon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-Anti-Maus-CD8, Klon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-Maus-TCR-β, Klon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-Maus-CXCR3, Klon 220.803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinyliertem Anti-Maus-CCR5, Klon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung und Material </td></tr><tr><td> SuperFrost Mikroskopobjektträger </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection Zangen, Scheren </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS Reservoir </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gummischlauch </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G Nadel </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Zelldissoziationslösung Kit mit Metallsieb </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um Nylon Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Durchflusszytometrie </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von adhärenten Entzündungszellen aus Gehirn Blutgefäße von P. berghei ANKA-infizierten Mäusen. Infektion von empfänglichen Maus-Stämme mit diesen Parasiten Dehnung ergibt sich bei der Induktion von experimenteller zerebrale Malaria, eine neurologische Syndrom daß rekapituliert bestimmte wichtige Aspekte des Plasmodium falciparum-vermittelte schwerer Malaria beim Menschen 1,2. Reifen Formen von Blut-stufigen Malaria exprimieren parasitäre Proteine ​​auf der Oberfläche der infizierten Erythrozyten, wodurch sie an vaskulären Endothelzellen binden können. Dieser Prozess induziert Hindernisse in den Blutfluss, was zu Sauerstoffmangel und Blutungen 3 und stimuliert auch die Rekrutierung von Entzündungszellen Leukozyten an den Ort der Parasit Sequestrierung. Im Gegensatz zu anderen Infektionen, also Viren neutrotopic 4-6, beide Malaria-Parasiten befallenen Erythrozyten (PRBC) sowie zugehörigen InflammAtory Leukozyten bleiben abgesondert innerhalb von Blutgefäßen als Infiltration des Hirnparenchym. So eine Kontamination des einsamen Leukozyten mit nicht-entzündlichen zirkulierenden Zellen, umfangreiche intrakardiale Perfusion von infizierten-Mäuse vor Organentnahme und Gewebe Verarbeitung zu vermeiden wird in diesem Verfahren erforderlich, um die Blut-Kompartiment zu entfernen. Nach Perfusion, werden geerntet und seziert Gehirne in kleine Stücke. Das Tissue-Struktur wird weiter durch enzymatische Behandlung mit Kollagenase D und DNAse I gestört Die resultierende Hirnhomogenisat wird dann auf einem Percoll-Gradienten, die Trennung von brain-sequestered Leukozyten (BSL) von Myelin und andere Gewebedebris ermöglicht zentrifugiert. Isolierte Zellen werden dann gewaschen, gezählt unter Verwendung eines Hämozytometers und gefärbt mit fluoreszierenden Antikörpern für die anschließende Analyse durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht eine umfassende phänotypische Charakterisierung von entzündlichen Leukozyten Migration auf das Gehirn in retion auf verschiedene Stimuli, einschließlich Schlaganfall sowie viralen oder parasitären Infektionen. Das Verfahren stellt auch ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung von neuartigen anti-inflammatorische Therapien in präklinischen Tiermodellen.

Die Ergebnisse in Abb.. 2 zeigen Prozentsätze und absolute Zahl der verschiedenen BSL Populationen aus Gehirnen von perfundierten oder unperfused Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen erholt. Isolated BSL wurden mit PE-anti-NK1.1 und APC-anti-TCR-β-Antikörper gefärbt, wie im Protokoll Text angezeigt. Übereinstimmend mit früheren Resultaten 7-9, bestehend αβTCR + T-Zellen einen hohen Anteil an der BSL Pool in Gehirnen von perfundierten Malaria-infizierte Mäuse (6 Tage pi). Diese Po...

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Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Verfahren zur Isolierung von adhärenten entzündliche Leukozyten aus dem Gehirn Blutgefäße<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierten Mäusen beschrieben. Das Verfahren ermöglicht die Quantifizierung sowie phänotypischen Charakterisierung von isolierten Leukozyten nach Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und anschließende Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...