Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare la signorina Liana Mackiewicz per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato reso possibile grazie vittoriana sostegno governativo Infrastrutture Stato operativo e del governo australiano National Health and Medical Research Council IRIISS e Progetto di sovvenzione 1.031.212.

1. L&#39;infezione di topi con P. berghei-ANKA <ol><li> Sbrinamento un&#39;aliquota di crioconservati P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Trattenere una malaria cerebrale resistente topo BALB / c donatore (8-12 settimane di età) con la tecnica a due mani di ritenuta. Iniettare il mouse con 100-200 ml di PRBC utilizzando un insulina siringa da 1 ml (28G ago). Di routine, 1-2 topi donatori vengono iniettati. </li><li> In 4-5 giorni post-infezione (pi) rimuovere topo donatore da gabbia e collocarla su una ...

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	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

L&#39;isolamento e l&#39;analisi di BSL è un metodo che permette la caratterizzazione e la quantificazione delle cellule infiammatorie migrazione al cervello in risposta al danno tissutale o infezione in modelli murini sperimentali. L&#39;introduzione di una fase di perfusione intracardial per la rimozione del comparto sangue prima dell&#39;estrazione organi e isolamento cellulare successiva è utile per prevenire la contaminazione di cellule infiammatorie con leucociti circolanti non-infiammatorie. Questo potrebbe non...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzioni e tamponi </td></tr><tr><td> Giemsa azur eosina blu metilene soluzione </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Diluizione 1:10 in acqua distillata </td></tr><tr><td> RPMI media </td><td></td><td></td><td> Mouse tonicità </td></tr><tr><td> Mouse tonicità PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM fosfato di sodio, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:2 </td></tr><tr><td> Collagenasi D </td><td> Biochimica Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAsi) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Da pancreas bovino </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> Soluzione al 30% in PBS </td></tr><tr><td> Ultrapura Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di ammonio (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nM NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA sale disodico </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anticorpi e coniugati </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ml in 50 microlitri tampone di colorazione (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-topo CD4, clone H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-topo NK1.1, clone PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-topo CD8, clone 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-topo TCR-β, clone H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-topo CXCR3, clone 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato anti-topo-CCR5, clone C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzature e materiali </td></tr><tr><td> SuperFrost vetrino da microscopio </td><td> Lomb Menzel-Glaser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinze, forbici dissezione </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS serbatoio </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubi in gomma vulcanizzata </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ago 23G </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Cella dissociazione kit contenenti metalli setaccio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron nylon filtro cella </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Neubauer GmbH </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Citometria a Flusso tubi </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Si descrive un metodo per l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule infiammatorie aderenti da vasi sanguigni cerebrali di P. berghei ANKA topi infettati. L&#39;infezione di ceppi sensibili del mouse con questo risultati di deformazione parassita nella induzione di sperimentale malaria cerebrale, una sindrome neurologica che riassume alcuni aspetti importanti del Plasmodium falciparum mediata da malaria grave in 1,2 esseri umani. Forme mature di sangue stadi malaria esprimere proteine ​​parassite sulla superficie del eritrociti infetti, che consente loro di legarsi a cellule endoteliali vascolari. Questo processo induce ostruzioni del flusso sanguigno, causando ipossia e 3 emorragie e stimola anche il reclutamento di leucociti infiammatori al sito di sequestro parassita. A differenza di altre infezioni, ad esempio virus neutrotopic 4-6, sia la malaria-parassitati globuli rossi (PRBC), così come associati inflammleucociti stre rimangono sequestrati all&#39;interno dei vasi sanguigni e non infiltrante il parenchima cerebrale. Perciò, per evitare la contaminazione di leucociti sequestrati con cellule circolanti non-infiammatorie, ampia perfusione intracardial di topi infetti-prima dell&#39;estrazione di organi e lavorazione dei tessuti è necessario in questa procedura per rimuovere il comparto sangue. Dopo la perfusione, i cervelli vengono raccolte e sezionati in piccoli pezzi. La struttura del tessuto è ulteriormente disturbato da trattamento enzimatico con collagenasi D e DNAsi I. L&#39;omogenato cerebrale risultante viene poi centrifugato su un gradiente di Percoll che permette la separazione dei cervelli sequestrati leucociti (BSL) mielina e detriti da altri tessuti. Cellule isolate vengono quindi lavate, contati utilizzando un emocitometro e colorate con anticorpi fluorescenti per la successiva analisi mediante citometria a flusso. Questa procedura consente una completa caratterizzazione fenotipica dei leucociti infiammatori migrazione al cervello in response a vari stimoli, compreso il colpo così come le infezioni virali o parassitarie. Il metodo prevede anche un utile strumento per la valutazione di nuovi trattamenti antinfiammatori in pre-clinici modelli animali.

I risultati in Fig. 2 percentuali di spettacoli e di numeri assoluti delle diverse popolazioni BSL recuperati da cervelli di perfusi o unperfused topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. Isolato BSL sono state colorate con PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR β-anticorpi, come indicato nel testo del protocollo. In linea con i risultati precedenti 7-9, αβTCR + cellule T comprende una percentuale elevata della piscina BSL nel cervello di perfusi malaria topi infettati (giorno 6 pi). Questa pop...

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Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Un metodo per l&#39;isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali dei<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati è descritto. Il metodo consente la quantificazione e caratterizzazione fenotipica di leucociti isolati dopo colorazione con anticorpi fluorescenti e successiva analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

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