Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

著者は、技術支援のためにミスリアナMackiewiczに感謝したいと思います。この作品は、ビクトリア州政府業務インフラのサポートとオーストラリア政府は国立保健医療研究評議会IRIISSとプロジェクト無償1031212により可能となった。

1。 P.によるマウスの感染ベルゲイ -ANKA <ol><li>霜凍結保存Pのアリコートベルゲイ ANKA PRBC。 </li><li>両手拘束技術を用いて、脳マラリア耐性のBALB / cドナーマウス（8-12週齢）を抑制する。 1mlのインスリン注射器（28G針）を使用して、PRBCの100から200μlでマウスを注入します。日常的に、1-2ドナーマウスが注入される。 </li><li>感染後4-5日で（pi）をケージからドナーマ?...

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

BSLの単離と解析、特性評価および実験マウスモデルにおける組織損傷または感染に反応して脳への移行の炎症性細胞の定量化を可能にする方法です。臓器の抽出とそれに続く細胞単離の前に血液区画の除去のための心臓内灌流ステップの導入は、非炎症性の循環白血球と炎症細胞の汚染を防止するのに有用である。これは、炎症細胞が脳実質5を貫通しているようなマウス脳?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ソリューションおよびバッファ </td></tr><tr><td>ギムザアズールエオシンメチレンブルー液</td><td>メルクミリポア</td><td> 1.09204.0500 </td><td>蒸留水で1:10に希釈</td></tr><tr><td> RPMI培地</td><td></td><td></td><td>マウス張</td></tr><tr><td>マウス張PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mMリン酸ナトリウム、0.149のNaCl、pH7.3の</td></tr><tr><td> 0.4％トリパンブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T-8154 </td><td> 1:2希釈</td></tr><tr><td>コラゲナーゼD </td><td>生化学ワージントン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease（DNアーゼ）私</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D4263-5VL </td><td>ウシ膵臓由来</td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0891-01 </td><td> PBS中30％溶液</td></tr><tr><td>純トリス</td><td>インビトロジェン</td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム（NH 4 Cl） </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td>赤細胞溶解バッファー</td><td></td><td></td><td> 17 mMトリス、14nMのNH 4 Cl、pH7.2の</td></tr><tr><td> FCS </td><td>ギブコ</td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA二ナトリウム塩</td><td>メルク</td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M、pH7.2の</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 抗体とコンジュゲート </td></tr><tr><td>抗マウスCD16/CD32（FCブロック）、クローン2.4G2 </td><td> BDファーミンジェン</td> &lt;TD&gt; 553142 </td><td> 50μLの染色緩衝液で1μL（0.5mg/50ミリリットル） </td></tr><tr><td> FITC-抗マウスCD4、クローンH129.19 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-抗マウスNK1.1、クローンPK136 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5抗マウスCD8、クローン53-6-7 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-抗マウスTCR-β、クローンH57-597 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-抗マウスCXCR3、クローン220803 </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスCCR5、クローンC34-3448 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-も、PerCP-Cy5.5 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器と材料 </td></tr><tr><td> SuperFrost顕微鏡スライド</td><td>ボシュロムメンツェル-グレイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖用ピンセット、はさみ</td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500ミリリットルのPBS貯水池</td><td>ナルゲン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゴムチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G針</td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td>金属ふるいを含む細胞解離キット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのナイロン細胞ストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td> GmbHはノイバウアー</td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー管</td><td> BDファルコン</td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

我々はPの脳血管から付着炎症細胞の単離および特性評価のための方法を説明ベルゲイ ANKA感染マウス。実験的脳マラリア、人間1,2における熱帯熱マラリア原虫媒介重症マラリアの再現する一定の重要な側面、その神経学的症候群の誘導にこの寄生虫のひずみの結果と感受性マウス系統の感染。血液段階のマラリアの成熟型は、それらが血管内皮細胞に結合することができます感染赤血球の表面に寄生するタンパク質を発現している。このプロセスでは、低酸素症および出血3、その結果、血流に障害を誘発し、また寄生虫隔離のサイトに炎症性白血球の動員を刺激する。 他の感染症とは異なり、すなわちneutrotopicウイルス4-6、両方マラリア寄生赤血球（PRBC）ならびに関連inflammatory白血球は血管内ではなく、脳実質に浸潤するより隔離のままである。したがって、非炎症性の循環細胞、臓器の抽出と組織の処理の前に感染したマウスの大規模な心臓内灌流による隔離白血球の汚染を避けるために、血液区画を削除する場合は、この手順が必要になります。灌流後、脳を採取し、小片に解剖した。組織構造は、さらにその結果脳ホモジネートは、その後ミエリンおよび他の組織片から脳隔離された白血球の分離（BSL）が可能パーコール勾配に遠心分離されるコラゲナーゼDとDNase Iで酵素処理によって破壊されています。単離された細胞は、その後、フローサイトメトリーによってその後の分析のための蛍光抗体と血球計数器とステンドを使用してカウントし、洗浄する。 この手順では、炎症性白血球の包括的な表現型の特徴は、再の脳への移行を可能にするストロークだけでなく、ウイルスや寄生虫感染症を含む様々な刺激に応答特性。この方法はまた、前臨床動物モデルにおける新規抗炎症治療の評価のための便利なツールを提供します。

図の結果。 2に示す比率と灌流したりunperfusedマラリアに感染し、ナイーブ対照マウスの脳から回収された別のBSLの人口の絶対数。議定書のテキストに示されているように隔離されたBSLは、PE-抗NK1.1およびAPC-抗TCR-β抗体で染色した。 7月9日以前の知見と一致して、αβTCR+ T細胞は、灌流しマラリア感染マウス（6日目PI）の脳におけるBSLプールの高い割合を占めている。この集団?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

の脳血管から付着炎症性白血球を単離するための方法<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウスが記載されている。この方法は、フローサイトメトリーによって蛍光抗体とその後の分析で染色した後に定量化ならびに単離された白血球の表現型の特徴を可能にします。

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

脳浸潤白血球の分離

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating肺白血球の選択的ハーベスティング

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...