Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Miss Liana Mackiewicz for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom viktoriansk delstatsmyndighetene Operasjonell Infrastruktur Support og australske regjeringen National Health and Medical Research Council IRIISS og Project Grant 1031212.

1. Infeksjon av mus med P. berghei-ANKA <ol><li> Defrost en delmengde av fryses ned P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Beherske et cerebral malaria-resistant BALB / c donor mus (8-12 uker gamle) med to-hånds tilbakeholdenhet teknikk. Injisere mus med 100-200 ul PRBC med en 1 ml insulinsprøyte (28g p). Rutinemessig, er 1-2 donor mus injisert. </li><li> På dager 4-5 etter infeksjon (pi) fjerne donor mus fra bur og legg den på en arbeidsstasjon eller en engangs arbeider pad. </li><li> Forsiktig begrens...

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

Isolering og analyse av BSL er en metode som tillater karakterisering og kvantifisering av betennelsesceller migrere til hjernen i respons til vevsskade eller infeksjon i eksperimentelle musemodeller. Innføringen av en intracardial perfusjon steg for fjerning av blod kupé før orgel utvinning og påfølgende celleisolasjon er nyttig for å hindre kontaminering av inflammatoriske celler med ikke-inflammatoriske sirkulerende leukocytter. Dette kan ikke være et viktig krav i neurotropisk infeksjoner som murint encefalom...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Løsninger og buffere </td></tr><tr><td> Giemsa er azur eosin metylenblått løsning </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 1:10 fortynning i destillert vann </td></tr><tr><td> RPMI medium </td><td></td><td></td><td> Mus tonicity </td></tr><tr><td> Mus tonicity PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM natriumfosfat, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypan Blå </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 01:02 fortynning </td></tr><tr><td> Kollagenase D </td><td> Worthington Biokjemisk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) jeg </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Fra storfe bukspyttkjertelen </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% løsning i PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumklorid (NH4Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nM NH4Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA disodium salt </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, 7,2 pH </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antistoffer og konjugater </td></tr><tr><td> Anti-mus CD16/CD32 (Fc Block), klone 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ul i 50 pl farging buffer (0,5 mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-mus CD4, klone H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-mus NK1.1, PK136 klone </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> CD8 PerCPCy5.5-anti-mus, 53-6-7 klone </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-mus TCR-β, klone H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-mus CXCR3, 220803 klone </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylert-anti-mus CCR5, klone C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utstyr og materiell </td></tr><tr><td> SuperFrost objektglass </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disseksjon tang, saks </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS reservoar </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gummi slanger </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G nål </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Cell dissosiasjon kit som inneholder metall sil </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikrometer nylon celle sil </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometri rør </td><td>BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Vi beskriver en fremgangsmåte for isolering og karakterisering av adherente inflammatoriske celler fra hjernen blodkar av P. Berghei ANKA-infiserte mus. Infeksjon av mottakelige mus-stammer med denne parasitten belastning fører til induksjon av eksperimentelle cerebral malaria, en nevrologisk syndrom som rekapitulerer visse viktige aspekter av Plasmodium falciparum-mediert alvorlig malaria hos mennesker 1,2. Modne former av blod-trinns malaria uttrykker parasittiske proteiner på overflaten av infiserte erytrocytt, som tillater dem å binde til vaskulære endotelceller. Denne prosessen induserer hindringer i blodstrømmen, noe som resulterer i hypoksi og blødninger 3 og også stimulerer til rekruttering av inflammatoriske leukocytter til området av parasitten håndtering. I motsetning til andre infeksjoner, dvs. neutrotopic virus 4-6, begge malaria-parasitized røde blodceller (PRBC) samt tilhørende inflammatory leukocytter forblir sequestered i blodkar enn infiltrere hjernen parenchyma. Dermed å unngå forurensning av sequestered leukocytter med ikke-inflammatoriske sirkulerende celler, omfattende intracardial perfusjon av infiserte-mus før organ utvinning og vev behandling er nødvendig i denne prosedyren for å fjerne blod kupé. Etter perfusjon blir hjerner høstes og dissekert i små biter. Vevet strukturen er ytterligere forstyrret ved enzymatisk behandling med kollagenase D og DNAse I. Det resulterende hjerne Homogenatet deretter sentrifugert på en Percoll gradient som tillater separasjon av hjerne-sequestered leukocytter (BSL) fra myelin og andre vev rusk. Isolerte celler vaskes deretter, telles ved hjelp av en hemocytometer og farget med fluorescerende antistoffer for etterfølgende analyse ved strømningscytometri. Denne prosedyren gir omfattende fenotypisk karakterisering av inflammatoriske leukocytter migrere til hjernen i reutvikling som svar på ulike stimuli, inkludert slag, så vel som virale eller parasittiske infeksjoner. Metoden gir også et nyttig verktøy for vurdering av nye anti-inflammatorisk behandling i pre-kliniske dyremodeller.

Resultatene i fig. 2 viser prosenter og absolutte tall av ulike BSL populasjoner utvinnes fra hjernen til perfused eller unperfused malaria-smittede og naive kontroll mus. Isolert BSL ble farget med PE-anti-NK1.1 og APC-anti-TCR-β antistoffer som angitt i protokollen teksten. I samsvar med tidligere funn 7-9 omfattet αβTCR + T-celler en høy andel av den BSL bassenget i hjernen perfusert malaria-infiserte mus (dag 6 pi). Denne populasjonen som syntes å være signifikant underrepresentert i hjer...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

En metode for isolering av adherente inflammatoriske leukocytter fra hjernen blodkarene<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infiserte mus, er beskrevet. Fremgangsmåten tillater kvantifisering samt fenotypisk karakterisering av isolerte leukocytter etter farging med fluorescerende antistoffer og påfølgende analyse ved strømningscytometri.

Isolering og analyse av Brain-sequestered Leukocytter fra<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infiserte mus

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En eksperimentell modell for å studere Tuberkulose-Malaria coinfection på Natural Overføring av Mycobacterium tuberculosis Og Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergi og Oksidativt Burst: Protokoller for isolering og evaluering av humane leukocytter og blodplater

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocytter fra Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerende Leukocytter fra Mouse Skin Bruke Enzymatisk Digest og Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myelogen Cell Isolasjon fra Mouse Hud og Drenering Lymph Node Etter Intradermal Immunisering med levende svekket<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitter

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektiv Høsting av Marginating-lunge Leukocytter

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...