Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a senhorita Liana Mackiewicz para assistência técnica. Este trabalho foi possível graças vitoriana Estado de Infra-estrutura de Apoio Operacional e Governo australiano Governo Nacional de Saúde e Conselho de Pesquisa Médica IRIISS e Projeto Grant 1031212.

1. Infecção de camundongos com P. berghei ANKA- <ol><li> Descongelação uma alíquota de P. criopreservado berghei ANKA CHA. </li><li> Conter um cerebral malária resistente rato BALB / c dador (8-12 semanas de idade), utilizando a técnica de retenção de duas mãos. Injectar mouse com 100-200 ul de concentrado de hemácias utilizando uma seringa de insulina 1 ml (28G agulha). Rotineiramente, 1-2 camundongos doadores são injetados. </li><li> Em 4-5 dias pós-infecção (pi) remover cam...

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	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

O isolamento e análise de BSL é um método que permite a caracterização e quantificação de células inflamatórias migram para o cérebro, em resposta a uma lesão tecidual ou infecção em modelos de ratos experimentais. A introdução de um passo de perfusão intracardíaca para a remoção do compartimento de sangue antes da extracção orgânica e o isolamento subsequente das células é útil para prevenir a contaminação de células inflamatórias com não-inflamatórios leucócitos circulantes. Isto pode n...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluções e tampões </td></tr><tr><td> Azur Giemsa de eosina solução azul de metileno </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Diluição de 1:10 em água destilada </td></tr><tr><td> Meio RPMI </td><td></td><td></td><td> Rato tonicidade </td></tr><tr><td> Rato tonicidade PBS </td><td></td><td></td><td> Fosfato de sódio 20 mM, NaCl 0,149, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> Diluição 1:2 </td></tr><tr><td> Colagenase D </td><td> Worthington Biochemical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> A partir de pâncreas bovino </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> Solução a 30% em PBS </td></tr><tr><td> Ultrapura Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de amônio (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de Lise Red Cell </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14NM NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA sal dissódico </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Os anticorpos e os conjugados </td></tr><tr><td> Anti-rato CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ul de tampão de coloração em 50 ul (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC anti-ratinho, clone CD4 H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-rato NK1.1, clone PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 anti-rato CD8, clone 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-rato de TCR-β clone, H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-rato CXCR3, clone 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado anti-CCR5 do mouse, clone C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento e material </td></tr><tr><td> SuperFrost lâmina de microscópio </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinça de dissecção, tesoura </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml de PBS reservatório </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo de borracha </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agulha de 23G </td><td> BD PrecisionGild </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Dissociação celular kit contendo metal peneira </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 filtro de células mM nylon </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Neubauer GmbH </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Citometria de fluxo de tubos </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Descreve-se um método para o isolamento e caracterização de células aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos cerebrais de P. berghei ANKA camundongos infectados. Infecção de estirpes de ratinho-sensíveis com estes resultados de deformação parasita na indução da malária cerebral experimental, uma síndrome neurológica que recapitula certos aspectos importantes da malária Plasmodium falciparum mediada grave em seres humanos 1,2. Formas maduras de sangue fase-malária expressar proteínas parasitas sobre a superfície dos eritrócitos infectados, o que lhes permite ligar-se a células endoteliais vasculares. Este processo induz a obstrução do fluxo sanguíneo, resultando em hipóxia e hemorragias 3 e também estimula o recrutamento de leucócitos inflamatórios para o local de fixação do parasita. Ao contrário de outras infecções, isto é, os vírus neutrotopic 4-6, ambos os malária parasitados glóbulos vermelhos (CGV), bem como associado Inflammleucócitos Atory permanecem sequestrados no interior dos vasos sanguíneos, em vez de se infiltrar no parênquima cerebral. Assim, para evitar a contaminação dos leucócitos sequestrados com não-inflamatórios de células circulantes, perfusão intracardíaca extensa de camundongos infectados-antes da extracção e processamento de tecidos de órgãos é necessária neste procedimento para remover o compartimento do sangue. Após a perfusão, os cérebros são colhidas e dissecado em pequenos pedaços. A estrutura de tecido é adicionalmente interrompido por tratamento enzimático com colagenase D e I. DNAse O homogenato de cérebro resultante é então centrifugado num gradiente de Percoll, que permite a separação de cérebro-sequestradas leucócitos (BSL) de mielina e detritos de outro tecido. As células isoladas são então lavadas, contadas utilizando um hemocitómetro e coradas com anticorpos fluorescentes para posterior análise por citometria de fluxo. Este procedimento permite a caracterização fenotípica abrangente de leucócitos inflamatórios migrar para o cérebro em response a vários estímulos, incluindo acidente vascular cerebral, bem como infecções virais ou parasitárias. O método também proporciona um instrumento útil para a avaliação de novos tratamentos anti-inflamatórias em modelos pré-clínicos com animais.

Os resultados na Fig. 2 percentagens de shows e números absolutos de diferentes populações BSL recuperados de cérebros de ratos perfundidos ou não perfundidada controle de infectados com malária e ingênua. BSL isolado foram coradas com PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR-β anticorpos, tal como indicado no texto Protocolo. Consistente com resultados anteriores 7-9, as células T αβTCR + compreendia uma elevada proporção da piscina BSL perfundidos em cérebros de ratos infectados com malária (d...

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Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Um método para o isolamento de leucócitos aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos do cérebro<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA camundongos infectados é descrito. O método permite a quantificação, bem como a caracterização fenotípica de leucócitos isolados, após coloração com anticorpos fluorescentes e subsequente análise por citometria de fluxo.

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Imunologia e Infecção

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...