Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить мисс Лиана Мацкевич технической помощи. Эта работа стала возможной благодаря викторианской государственного управления оперативной поддержки инфраструктуры и австралийское правительство национального здравоохранения и медицинских исследований Совета IRIISS и гранта 1031212.

1. Заражение мышей с P. berghei-ANKA <ol><li> Размораживание аликвоты криоконсервированных P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Сдерживать церебральной малярии, устойчивых BALB / с донорами мышь (8-12 недель от роду) с помощью двуручной сдержанность техники. Inject мыши с 100-200 мкл PRBC использованием 1 мл инсулинов?...

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

Выделения и анализа BSL это метод, который позволяет характеристика и количественная воспалительных клеток мигрируют в мозг в ответ на повреждение ткани или инфекции в экспериментальной модели мышей. Введение внутрисердечной шаг перфузии для удаления крови отсека до извлечения орган?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Решения и буферы </td></tr><tr><td> Берег Гимза в эозином метиленовым синим решения </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Разведении 1:10 в дистиллированной воде </td></tr><tr><td> RPMI среде </td><td></td><td></td><td> Мышь тонуса </td></tr><tr><td> Мышь тонус PBS </td><td></td><td></td><td> 20 мМ фосфат натрия, 0,149 NaCl, рН 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% трипанового синего </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:02 разбавление </td></tr><tr><td> Коллагеназа D </td><td> Уортингтон Биохимические </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (ДНКазы) я </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Из бычьей поджелудочной железы </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% раствор в PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Хлорида аммония (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Красный буфера лизиса клеток </td><td></td><td></td><td> 17 мМ Tris, 14nM NH 4 Cl, рН 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> ЭДТА динатриевая соль </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 М, рН 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Антитела и конъюгаты </td></tr><tr><td> Anti-мышь CD16/CD32 (Fc Block), клон 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;TD&gt; 553142 </td><td> 1 мкл в 50 мкл буфера окрашивания (0.5mg/50 мл) </td></tr><tr><td> FITC анти-CD4 мыши, клон H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-анти-мышиных NK1.1, клон PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-анти-CD8 мыши, клон 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-анти-мышь TCR-β, клон H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-анти-мышиных CXCR3, клон 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Биотинилированных анти-мышь CCR5, клон C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Оборудование и материалы </td></tr><tr><td> SuperFrost стекло микроскопа </td><td> Lomb Менцель-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Препарирование щипцы, ножницы </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 мл PBS водохранилище </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Резиновые трубки </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G иглу </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Клеточная диссоциация набор, содержащий металлическое сито </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 мкм фильтр клетки нейлон </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Гемоцитометр </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Трубы проточной цитометрии </td><td> СиD Сокол </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Мы описываем метод выделения и характеристика приверженцем воспалительных клеток из мозга кровеносных сосудов P. berghei ANKA-инфицированных мышей. Заражение восприимчивых мыши штаммов с этим паразитом результаты напряжение в индукционной экспериментальной церебральной малярии, неврологического синдрома, который повторяет некоторые важные аспекты Plasmodium тропической опосредованной тяжелой малярии в 1,2 человека. Зрелые формы крови стадии малярии выразить паразитарных белков на поверхности зараженных эритроцитов, что позволяет им связываться с сосудистых эндотелиальных клеток. Этот процесс вызывает препятствия в кровоток, что приводит к гипоксии и кровоизлияния 3, а также стимулирует набора воспалительных лейкоцитов к месту паразита углерода. В отличие от других инфекций, т.е. neutrotopic вирусы 4-6, как малярия зараженных эритроцитов (PRBC), а также связанные InflammAtory лейкоцитов оставаться поглощенным в кровеносных сосудах, а не проникают в паренхиму мозга. Таким образом, чтобы избежать загрязнения поглощенных лейкоцитами с невоспалительные циркулирующих клеток, обширная внутрисердечной перфузии зараженных мышей до извлечения органов и тканей, обработка требуется в этой процедуре, чтобы удалить кровь отсека. После перфузии мозга собирают и расчлененные на мелкие кусочки. Структуры тканей в дальнейшем нарушается ферментативной обработки с коллагеназы D и ДНКазы I. В результате мозг гомогенат центрифугировали в градиенте Percoll, который позволяет разделение мозга секвестрированных лейкоцитов (BSL) из миелина и другим мусором ткани. Изолированные клетки затем промывают, рассчитывали с использованием гемоцитометр и окрашенных флуоресцирующих антител для последующего анализа методом проточной цитометрии. Эта процедура позволяет комплексно фенотипическая характеристика воспалительных лейкоцитов мигрируют в мозг, в реответа на различные раздражители, в том числе инсульта, а также вирусных и паразитарных инфекций. Этот метод также является полезным инструментом для оценки романа противовоспалительное лечение в доклинических моделях животных.

Результаты на рис. 2 показывают проценты и абсолютные числа различных BSL населения оправился от мозгов перфузии или unperfused-инфицированных малярией и наивно контрольных мышей. Изолированные BSL окрашивали PE-анти-NK1.1 и APC-анти-TCR-β антитела, как указано в тексте Протокола. В соответствии с пр?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Метод выделения приверженцем воспалительных лейкоцитов из мозга кровеносных сосудов<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-инфицированных мышей описано. Метод позволяет количественное, а также фенотипической характеристике изолированного лейкоцитов после окрашивания флуоресцирующих антител и последующий анализ с помощью проточной цитометрии.

Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-инфицированных мышей

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Выделение Брейн-Лейкоциты проникают

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Миелоидный Выделение клеток из кожи мышей и Слив лимфатического узла После внутрикожной иммунизации с живой аттенуированной<em&gt; Plasmodium</em&gt; Спорозоиты

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Селективный Заготовка Marginating-легочными Лейкоциты

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...