Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Författarna vill tacka fröken Liana Mackiewicz för tekniskt stöd. Detta arbete har gjorts möjlig genom viktorianska delstatsregeringen driftsinfrastruktur Support och Australiens regering National Health och Medicinska forskningsrådet IRIISS och projektbidrag 1.031.212.

1. Infektion av möss med P. berghei-ANKA <ol><li> Avfrostning en alikvot av frysförvarade P. berghei ANKA pRBC. </li><li> Hålla en cerebral malaria-resistent BALB / c givare mus (8-12 veckor gamla) med två-handed återhållsamhet teknik. Injicera mus med 100-200 pl pRBC med en 1 ml spruta (28G nål). Rutinmässigt är 1-2 donatormöss injiceras. </li><li> På dagarna 4-5 efter infektion (pi) avlägsna givare mus från bur och placera den på en arbetsstation eller en engångs arbetar pad. </li><l...

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

Isolering och analys av BSL är en metod som möjliggör karakterisering och kvantifiering av inflammatoriska celler migrerar till hjärnan som svar på vävnadsskada eller infektion i experimentella musmodeller. Införandet av en intracardial perfusion steg för avlägsnande av blod facket innan orgel extraktion och efterföljande cellisolering är användbart för att förhindra kontaminering av inflammatoriska celler med icke-inflammatoriska cirkulerande leukocyter. Detta kan inte vara ett viktigt krav i neurotropa i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösningar och buffertar </td></tr><tr><td> Giemsa s azur eosin lösning av metylenblått </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 1:10 spädning i destillerat vatten </td></tr><tr><td> RPMI-medium </td><td></td><td></td><td> Mus tonicitet </td></tr><tr><td> Mus tonicitet PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM natriumfosfat, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% trypanblått </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:2 utspädning </td></tr><tr><td> Kollagenas D </td><td> Worthington Biochemical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DeoxyribonuClease (DNAs) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Från bovin pankreas </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% lösning i PBS </td></tr><tr><td> Ultrarent Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumklorid (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10.017 </td><td></td></tr><tr><td> Röd Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nM NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA-dinatriumsalt </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikroppar och konjugat </td></tr><tr><td> Anti-mus CD16/CD32 (Fc Block), klon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553.142 </td><td> 1 il i 50 | il färgningsbuffert (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-mus CD4 klon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553.651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-mus NK1.1, klon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553.165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-mus CD8, klon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551.162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-mus-TCR β, klon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553.174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-mus CXCR3, klon 220.803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylerad anti-mus-CCR5, klon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559.922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551.419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning och material </td></tr><tr><td> SuperFrost mikroskop </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissekering pincett, sax </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS reservoar </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gummislang </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G nål </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302.008 </td><td></td></tr><tr><td> Cell dissociation sats innehållande metall sikt </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um nylon cellfilter </td><td> BD Falcon </td><td> 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717.810 </td><td></td></tr><tr><td> Flödescytometri rör </td><td> BD Falcon </td><td> 352.008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Vi beskriver en metod för isolering och karaktärisering av vidhäftande inflammatoriska celler från fartyg hjärnan blod av P. berghei ANKA-infekterade möss. Infektion av mottagliga mus-stammar med denna parasit stam resulterar i induktion av experimentell cerebral malaria, en neurologisk syndrom som rekapitulerar vissa viktiga aspekter av Plasmodium falciparum-medierad svår malaria hos människor 1,2. Mogna formerna av blod steg malaria uttrycker parasitiska proteiner på ytan av den infekterade erytrocyt, vilket tillåter dem att binda till vaskulära endotelceller. Denna process inducerar hinder i blodflödet, vilket resulterar i hypoxi och blödningar 3 och stimulerar rekryteringen av inflammatoriska leukocyter till stället för parasiten kvarstad. Till skillnad från andra infektioner, dvs neutrotopic virus 4-6, båda malaria parasiterade röda blodkroppar (pRBC) samt tillhörande Inflammatory leukocyter förblir binds i blodkärlen i stället infiltrera hjärnparenkymet. Således att undvika kontaminering av binds leukocyter med icke-inflammatoriska cirkulerande celler, omfattande intracardial perfusion av infekterade möss före orgel utvinning och vävnad bearbetning krävs denna procedur för att ta bort blodet facket. Efter perfusion är hjärnor skördas och dissekerades i små bitar. Vävnadsstrukturen ytterligare störs av enzymatisk behandling med kollagenas D och DNAs I. Det resulterande hjärnhomogenat sedan centrifugeras på en Percoll-gradient som möjliggör separation av hjärnan binds leukocyter (BSL) från myelin och annan vävnad skräp. Isolerade celler tvättas sedan, räknades med användning av en hemocytometer och färgades med fluorescerande antikroppar för efterföljande analys genom flödescytometri. Detta förfarande möjliggör omfattande fenotypisk karaktärisering av inflammatoriska leukocyter migrerar till hjärnan i rerespons till olika stimuli, inklusive stroke, liksom virala eller parasitiska infektioner. Metoden ger också ett användbart verktyg för bedömning av nya anti-inflammatoriska behandlingar i prekliniska djurmodeller.

Resultaten i FIG. 2 visar procenttal och absoluta antalet olika BSL populationer återhämtat sig från hjärnan hos perfunderade eller unperfused malaria-infekterade och naiv kontrollmöss. Isolerad BSL färgades med PE-anti-NK1.1 och APC-anti-TCR-β antikroppar såsom anges i protokollet texten. Konsekvent med tidigare fynd 7-9 bestod αβTCR + T-celler en hög andel av BSL poolen i hjärnorna hos perfunderade malaria-infekterade möss (dag 6 pi). Denna population verkade vara betydligt underrepr...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

En metod för isolering av vidhäftande inflammatoriska leukocyter från fartyg hjärnan blod av<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infekterade möss beskrivs. Metoden medger kvantifiering samt fenotypisk karakterisering av isolerade leukocyter efter färgning med fluorescerande antikroppar och efterföljande analys med flödescytometri.

Isolering och analys av Brain-binds Leukocyter från<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infekterade möss

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolering av Brain-infiltrera leukocyter

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

En experimentell modell för att studera Tuberculosis-Malaria Coinfection på Natural Överföring av Mycobacterium tuberculosis Och Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik och Oxidativ Burst: Protokoll för isolering och utvärdering av humana leukocyter och trombocyter

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid cellisolering från mushud och dränerande lymfkörteln Efter Intradermal immunisering med levande försvagade<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiter

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektiv Skörd av Marginating-lung leukocyter

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...