Name: isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Yazarlar teknik yardım için Bayan Liana Mackiewicz teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme ve Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi IRIISS ve Proje Hibe 1031212 sayesinde mümkün oldu.

1. P. ile Fare enfeksiyonu berghei-ANKA <ol><li> Defrost kriyoprezerve P. bir kısım berghei ANKA pRBC. </li><li> Iki elli emniyet tekniği kullanılarak serebral sıtma dirençli BALB / c donör fare (8-12 hafta-eski) dizginlemek. Bir 1 ml insülin şırınga (28G iğne) kullanarak pRBC 100-200 ul fare enjekte. Rutin olarak, 1-2 verici farelere enjekte edilir. </li><li> Enfeksiyon sonrası 4-5 gün hakkında (pi) kafes donör fare çıkarın ve bir iş istasyonu veya bir tek çal?...

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

BSL izolasyonu ve karakterize edilmesi ve analiz deneysel fare modellerinde doku hasarı ya da enfeksiyona yanıt olarak beyin göç inflamatuar hücrelerin miktarının sağlayan bir yöntem. Organ ekstraksiyonu ve bunu izleyen hücre izolasyonu önce kan bölmesinin çıkarılması için bir intracardial perfüzyon adım giriş non-inflamatuar dolaşımdaki lökositler ile inflamatuar hücrelerin kirlenmesini önlemek için yararlıdır. Bu inflamatuar hücreler beyin parankimi 5 nüfuz hangi tür kemirgen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözümler ve tamponlar </td></tr><tr><td> Giemsa en azur eosin metilen mavisi çözeltisi </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Distile su 1:10 seyreltme </td></tr><tr><td> RPMI medyumu </td><td></td><td></td><td> Fare tonisite </td></tr><tr><td> Fare tonisite PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM sodyum fosfat, 0.149 NaCl, pH 7.3 </td></tr><tr><td> % 0,4 Tripan Mavisi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:02 dilüsyon </td></tr><tr><td> Kollajenaz D </td><td> Biyokimyasal Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Sığır pankreas Gönderen </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> PBS içinde% 30 çözelti </td></tr><tr><td> Ultra Saf Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Amonyum Klorür (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı Hücre Lizis Tampon </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nm NH4CI, pH 7.2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA disodyum tuzu </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M, pH 7.2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikorlar ve konjugatlarının </td></tr><tr><td> Anti-fare CD16/CD32 (Fc Blok), klon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553.142 </td><td> 50 ul boyama tampon içinde 1 ul (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-fare CD4, klon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-fare NK1.1, klon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-fare CD8, klon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-fare anti-TCR-β, klon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-fare CXCR3, klon 220.803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinlenmiş-anti-fare CCR5, klon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman ve malzeme </td></tr><tr><td> SuperFrost mikroskop lamı </td><td> Lomb Menzel-Glaser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps, makas </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS rezervuar </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kauçuk hortum </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G iğne </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre ayrışma kiti metal elek içeren </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikron naylon hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri tüpler </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

Biz P. beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir yöntem tarif berghei ANKA-enfekte fareler. Deneysel serebral sıtma indüksiyon, bir nörolojik sendromu bu parazitin suşu sonuçlar duyarlı fare suşlarının enfeksiyonu insanlarda 1,2 Plasmodium falciparum aracılı şiddetli sıtma özetlediği bazı önemli yönleri olduğunu. Kan aşama sıtma Olgun formlar vasküler endotel hücreleri ile bağlamak sağlar enfekte eritrosit, yüzeyi üzerinde parazit proteinleri ifade eder. Bu süreç hipoksi ve kanamalar 3 sonuçlanan kan akımında engel indükler ve aynı zamanda parazit sekestrasyon sitesine inflamatuvar lökositlerin işe uyarır. Diğer enfeksiyonlar, örneğin neutrotopic virüsler 4-6, sıtma-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC) yanı sıra ilişkili yatkın aksine, hemekspirayon lökositlerin kan damarları içindeki yerine beyin parankimi infiltre daha münzevi kalır. Böylece non-inflamatuar dolaşan hücre, organ çıkarma ve doku işleme öncesi enfekte-farelerin geniş intracardial perfüzyon ile sekestre lökositlerin kirlenmesini önlemek için kan bölmesi çıkarmak için bu prosedürü gereklidir. Perfüzyon sonra, beyinleri hasat edilir ve küçük parçalar halinde disseke. Dokuların yapısı daha da oluşan beyin homojenat sonra miyelin ve diğer doku enkaz beyin sekestre lökositlerin ayrılması (BSL) sağlayan bir Percoll degrade üzerinde santrifüj edilir Kollajenaz D ve DNAz I. ile enzimatik tedavi ile bozulur. İzole hücreler daha sonra yıkanır, flow sitometri ile sonraki analiz için floresan antikorlar ile hemasitometre ve lekeli kullanılarak sayıldı. Bu prosedür inflamatuvar lökositlerin kapsamlı fenotipik karakterizasyonu re beyin göç veriyorinme gibi viral veya paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli uyarılara yanıtı. Yöntemi de klinik öncesi hayvan modellerinde yeni anti-inflamatuvar tedaviler değerlendirilmesi için yararlı bir araç sağlar.

Şekil sonuçlanır. 2 gösteri yüzdeleri ve perfüze veya unperfused sıtma ile enfekte olmuş ve naif kontrol farelerin beyinleri kurtarıldı farklı BSL nüfus mutlak sayıları. Protokol metninde de belirtildiği gibi İzole BSL PE-anti-NK1.1 ve APC-anti-TCR-β antikorları ile boyandı. Önceki bulguları 7-9 ile uyumlu olarak, αβTCR + T hücreleri perfüze sıtma ile enfekte farelerde (günde 6 pi) ve beyinlerinde BSL havuzu yüksek oranda oluşur. Bu nüfusun önemli ölçüde (Şekil 2A...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir yöntem<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA ile enfekte olmuş fareler tarif edilmektedir. Yöntemi flow sitometri ile floresan antikorlar ve müteakip analizler ile boyanarak miktarının yanı sıra izole lökositlerin fenotipik karakterizasyonu sağlar.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating pulmoner lökosit seçici Hasat

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...