Name: gene trapping using gal4 in zebrafish
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Vi takker Dr. Jennifer Emtage for kritisk læsning af manuskriptet, Ryan Gill til teknisk bistand og hjælp med zebrafisk omhu og Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) reagenser. Vores arbejde er blevet støttet af Temple University College for Videnskab og Teknologi og National Institutes of Health (R01-HD061749).

1.. Produktionen af ​​F0 generation ved mikroinjektion af Gene Trap. Vi har fundet, at embryoner af forskellige genetiske baggrunde vise forskellige tolerancer for denne procedure, med pet-store-baserede vildtype og Tübingen - Lang Fin (TLF) er de mest tolerante, mens AB og Tuebingen stammer har dårligere overlevelse. <ol><li> Fremstilling af transposon-DNA. Forbered GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. Under forberedelse) plasmid-DNA ved hjælp af standard QIAprep miniprep (Qiagen 27106). Det er vigtigt at medtage PB vasketrinnet (som er valgfri i QIAprep procedure), ellers miniprep DNA vil blive forurenet af RNase A, hvilket fører til nedbrydning af transposasen mRNA. Før injektion fortyndes DNA i RNase-frit vand (Ambion AM9937) til 10 ng / ul. </li><li> Fremstilling af transposase mRNA. Linearize pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 ved anvendelse XbaI og transskribere lineariserede DNA ved hjælp af en mMessage Machine T3(Ambion AM1348) in vitro transcription kit. Vi har modificeret in vitro transcription reaktionen ved tilsætning af 0,5 pi RiboLock RNase inhibitor (ThermoFisher Fermentas EO0381). Efter trin DNase behandling, rense mRNA under anvendelse af et RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Vurdere kvaliteten af in vitro-transskriberet mRNA ved agarosegelelektroforese. Fortynd mRNA i RNase-frit vand til 40 ng / ul, og gemmes som 2 gl portioner ved -80 ° C. </li><li> Fremstilling af mikroinjektion mix. Før injektion, tilsættes 8 pi fortyndet transposon-DNA til en 2 pi alikvot af transposase mRNA. </li><li> Mikroinjektion. Der indsprøjtes 3 nl af DNA / RNA-blandingen ind i blommen af ​​1 celle zebrafisk embryoner ved hjælp af standard Mikroinjektionsteknikker, sigter til blommesækken / blastomere interface. Saml embryoner hver 20 min for at sikre injektion ved 1 celle stadie. Det er vores erfaring, kan en dygtig person let injicere 1.000 embryoner i 1-1,5 time. </li><li> Efter injektion, løbe 5 pi venstreløbet injektionsopløsning på en 1% agarosegel for kvalitetskontrol, at sikre, at transposasen mRNA ikke er nedbrudt. </li><li> Indsprøjtet embryo pleje. I slutningen af ​​eftermiddagen fjerne ubefrugtede og abnorme embryoner og distribuere embryoner til 60-80 per 100 mm petriskål. Unormale og døde fostre fjernes ved 1 dag efter befrugtning (DPF), 2 dpf og 3 dpf. </li><li> Screening for GFP-ekspression. Screen embryoer uden synlige defekter for GFP-fluorescens ved 3 dpf (figur 3). Screening kan ske enten på et stereomikroskop forsynet med fluorescens (vi bruger Nikon et SMZ1500) eller på en opretstående mikroskop (vi bruger en Zeiss AxioImager med en 5x Fluar målsætning). Lav GFP udtryk angiver enten mislykket injektion eller forringelse af transposasen RNA grund RNase forurening (figur 3A). Vælg omkring 30% af de lyseste embryoner, som enten har GFP-ekspression i flere væv eller i en høj procentdel af celler i et specifikt væv (sammenlign Figures 3B og 3C). Fra en injektion af 1.000 embryoner, vi normalt har op til 100 udviklingsmæssigt normal, høj-GFP-udtrykkende embryoner. </li><li> Hæv udvalgte F0 embryoner ved standardprocedurer zebrafisk opdræt. Det er rimeligt at forvente, at 20-30% af de injicerede embryoner udvalgt til opdræt vil overleve til voksenalderen. </li></ol> 2. Vedligeholdelse af UAS: mRFP Tester Line. Vi har genereret en 14xUAS: mRFP linje præget af linse-specifik γCry: GFP. Da UAS er underlagt silencing gennem DNA-methylering, er det vigtigt at vælge fisk med lave niveauer af silencing at udbrede bestanden. <ol><li> Oprette individuelle UAS: mRFP homozygote for parring med en af vores mest pålidelige Gal4 gen fælde linjer, NSF tpl6 (Balciuniene m.fl. under udarbejdelse.). </li><li> Den næste dag, overføre UAS: mRFP fisk, som gav embryoner til individuelle stationære tanke, mens embryonerne opsamlesog rengøres. </li><li> Screen embryoner til GFP og RFP fluorescens ved 1 dpf og 3 dpf. </li><li> Intercross fisk, som gav embryoner med høj mRFP udtryk for at etablere den næste generation af UAS: mRFP linje. </li></ol> 3. Screening af F0 fisk. <ol><li> Indlæg individuel F0 med homozygot UAS: mRFP fisk (Figur 4). Vi plejer at injicere vores GBTs i linjer med vildtype-eller leopard pigmentering mønstre og vore homozygote UAS: mRFP linje er i messing baggrund. Derfor GBT indsprøjtning F0 fisk let kan skelnes fra UAS: mRFP fisk, hvilket eliminerer behovet for at optage om F0 screenet var en mandlig eller en kvindelig samt potentielle fejl som følge af fejl i optagelse og / eller bestemmer køn hver fisk. Personale med meget begrænset erfaring, sådan os bachelorstuderende, er derfor i stand til at oprette og nedbryde fisk parringer. Denne fremgangsmåde har en ulempe, at to forskellige genetiske baggrunde erbliver brugt, potentielt komplicerer fortolkningen af ​​tab af funktion fænotyper. </li><li> Den næste dag, returnere messing UAS: mRFP fisk til deres tank. Placer F0 fisk, som gav embryoner i individuelle stationære tanke (vi bruger Hagen Exo Terra Faunarium Lille, men enhver lille tank kan bruges til dette formål), mens embryonerne opsamles og screenes. </li><li> Ren og overføre indsamlede embryoner til nye petriskåle (&lt;100 pr fad) om eftermiddagen den dag 0. </li><li> Screen embryoner til GFP og RFP fluorescens ved 1 dpf, 2 dpf og 3 dpf. Træk embryoner positive for både GFP og RFP ud, sortere dem efter GFP / RFP udtryk mønster (hvis der observeres mere end et mønster i en kobling), og hæve dem til at etablere F1 generation. </li><li> Aflive F0 fisk, der produceres kun negative embryoner (ud af et samlet antal på 50-100 embryoner). </li><li> Kryds F0 fisk, der produceres GFP / afkom RFP-positiv igen for at få et andet parti af positiver. </li></ol> 4..Screening af F1 fisk. F1 fisk er screenet for at etablere F2 familier at dokumentere gen fælde udtryk mønster og at fryse partier af embryoner til molekylær identifikation af gen-fælde loci med 5 &#39;RACE og invers PCR. <ol><li> Indlæg individuelle F1 fisk med den homozygote UAS: mRFP fisk (Figur 4). </li><li> Næste dag, placere F1 fisk, der gav embryoner i individuelle stationære tanke mens embryonerne opsamles og screenes. </li><li> Screen embryoner til GFP og RFP fluorescens ved 1 dpf, 2 dpf og 3 dpf. Separate og fotografere embryoner positive for både GFP og RFP 24. </li><li> Ved 5 dpf, fryse partier af 20 GFP / RFP-positive og 20 GFP / RFP-negative embryoner til identifikation af insertionally muterede gener ved invers PCR og 5 &#39;RACE 9,10. Hæv resterende GFP / RFP-positive fostre at etablere F2-generationen. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

Disse forfattere har intet at afsløre.

Genet fælde vektorer og metoder er beskrevet her, bliver allerede brugt i flere uafhængige laboratorier. Det er vores erfaring, er der to kritiske trin i processen. Det første afgørende skridt er at opnå høje gen fælde integration i injicerede F0 embryoner. Svigt på dette trin kan ofte tilskrives RNase forurening af injektion reagenser, især miniprep DNA. Det er også meget vigtigt at injicere embryoner ved 1 cellestadiet til gen-trap-eksperimenter. Det er vores erfaring, Tol2-medieret transgenese er meget effektiv, hvilket gør det muligt at opnå transgene linier, selv når indsprøjtning senest den 1. celle scenen eller med lavere kvalitet DNA. Deklasserede injektioner er langt mere problematisk, når de udfører gen fælde mutagenese, da kun en lille brøkdel af vektor integrationer resulterer i effektive gen trap begivenheder. Det andet afgørende skridt er at fastslå gen fælde begivenheder ved at krydse vores UAS: mRFP linje. Fravær af mRFP udtryk ernæsten altid indikativ for en enhancer trap begivenhed. Men nogle gange manglende mRFP udtryk kan indikere undertrykkelse af de 14x UAS. Det er derfor vigtigt at fastholde UAS: mRFP linje i en ikke-lyddæmpet tilstand ved at udbrede næste generation bruger personer med høj RFP udtryk, når krydset til NSF tpl6. Vi kan forudse at gøre flere forbedringer i vores gen fælde vektorer og protokol. Den første er at anvende en mindre gentagne UAS i genet fælde konstruktion. Det er blevet vist, at en 5x UAS er tilstrækkeligt til at opnå fuld aktivering i celle kultur eksperimenter, og at mindre repetitive UAS-sekvenser er mindre modtagelige for methylering og silencing 6,25. Det kan også være muligt at designe gen fælde vektorer for fuldt betinget mutagenese i lighed med de vektorer, der anvendes af det internationale musegen fælde konsortium og for nylig tilpasset til zebrafisk 2,26,27. En anden forbedring ville være at anvende en anden transposon, for eksempel Sleeping Beauty 28 at generere en UAS: mRFP reporter linje. Dette ville give injektion af Tol2-baserede gen fælder direkte ind i reporter linje og screening af F0s ved incrossing. Desuden vil det eliminere brugen af ​​to forskellige genetiske baggrunde, hvilket gør fortolkningen af ​​tab af funktion fænotyper mere ligetil. Selv med disse forbedringer, vil den generelle Gal4 gen fælde protokol præsenteres her stadig være fuldt ud gældende.

Insertionsmutagenese har vist sig at være en kraftfuld metode til at dissekere genfunktion i forskellige modelsystemer fra encellede organismer som bakterier og gær til flercellede organismer, såsom mus og planter. Enhver exogene DNA (virus, transposon eller plasmid), kan tjene som et mutagen ved at afbryde væsentlige elementer af gener såsom exons eller promotorer. Den effektive mål for sådanne enkle metoder er overordentlig lille i store komplekse genomer, da exons udgør kun 1-3% af en typisk hvirveldyr genom. Lille effektiv mål størrelse kan overvindes ved meget høj vektor integration satser, som eksemplificeret ved den enorme succes retroviral insertionsmutagenese i zebrafisk 11,12. I modsætning hertil introner omfatter omkring 20-30% af hvirveldyr genomer. I zebrafisk, transposon-baserede insertionsmutagenese vektorer, der effektivt indføre nul-eller svære hypomorphic mutationer på en integration i introns har fået navnet &quot;gen bryde transposons &quot;(GBTs) 8-10. Til effektiv gen fælde integration, de bruger en minimal Tol2 transposon 13,14. Mutagenicitet af GBTs afhængig fiske-afledte splejsningsacceptor og transkriptionstermineringssekvenser / polyadenyleringssekvenser. Elementerne er ansvarlige for GBT mutagenicitet flankeres ved direkte loxP sites for excision af Cre rekombinase. Således injektion af Cre mRNA fører til en effektiv reversion af GBT-inducerede mutationer, selv om nogle transposonsekvenser forbliver på integrationen locus 9,10. De nyligt offentliggjorte GBT vektorer bruger mRFP som genet fælde reporter 9,10, hvilket fører til to potentielle mangler. For det første er det ikke vidst, hvad brøkdel af zebrafisk gener er udtrykt på et højt nok niveau til at blive opdaget af direkte fluorescerende reporter fusionsproteiner. For det andet er det kun en lille delmængde af gener, der forventes at have væsentlige funktioner. Det er blevet anslået, at der kun er 1,400-2,400 gener kræves for zebrafisk development 15,16. De fleste gen trap mutanter forventes ikke at vise åbenlyse fænotyper og vil derfor have begrænset nytte. For at overvinde disse to begrænsninger, har vi modificeret GBT-R15 9,10 til brug med Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter (Balciuniene et al. Under udarbejdelse). Som med Aug-mindre mRFP i GBT-R15 blev translationsstartstedet fjernet fra Gal4-VP16. Til direkte påvisning af gen-trap begivenheder vore vektorer indeholder en eGFP reporter under kontrol af 14x Gal4 UAS 17,18. Flere ekstra funktioner er udviklet i vores todelte genfældevektoren. UAS&#39;et: eGFP kassetten er flankeret af direkte FRT sites (grå vinkler i figur 1). Injektion af Flp recombinase mRNA fører til udtagelse af UAS: eGFP kassette, forlader gen fælde mutation umærket af eGFP fluorescens. Det kan derefter anvendes i transgene linier, der markerer specifikke væv eller udviklingsmæssige begivenheder ved GFP-fluorescens. Som i andreGBTs er hele genet fælde kassette flankeret af direkte loxP sites (åbne femkanter i figur 1). Dette gør gen fælde begivenheder reversibel ved ekspression af Cre rekombinase, let at opnå bevis for kausalitet mellem en bestemt gen fælde integration og observerede fænotype (figur 2). Endelig genet fælde kassette flankeret af inverterede I-Scel meganuclease sites (sorte trekanter i figur 1). I Drosophila er transposonsekvenser integrationer ofte konverteres til sletninger (mangler) ved upræcis udskæring af P-element. Der er ingen beviser for, at excision af Tol2 transposon (eller enhver anden transposon aktiv i hvirveldyr såsom Tornerose, PiggyBac eller Ac / Ds), kan føre til sletninger. Vi inkluderede derfor I-SCEI sites som en potentiel surrogat metode til induktion af sletninger, selvom der ikke er noget bevis for, at I-Scel kan fremkalde sletninger i zebrafisk. Det skal bemærkes, at mens I-Scel meganuclease kan anvendes til at lette gensplejsning i zebrafisk, er DNA-spaltning af I-Scel meganuclease anvendes til at undersøge DNA-reparation mekanismer, herunder fejlbehæftet ikke-homolog ende sammenføjning, i gær og mammale celler 19-22. Integration af vores genfældevektoren kan føre til eGFP ekspression af to forskellige mekanismer. Den første er en sand gen fælde begivenhed (Figur 1C): vektoren integreres i et gen (IMG for Insertionally muterede gen), en fusion afskrift mellem 5 &#39;af endogene IMG udskrift og Gal4-VP16 er lavet og omsættes til en fusionsprotein indeholdende den N-terminale ende af proteinet kodet af IMG og Gal4-VP16. Dette fusionsprotein binder til 14x UAS og aktiverer transkription af eGFP. Den anden, mindre ønskeligt begivenhed er en enhancer trap (figur 1D): Den minimale promotor foran eGFP falder under kontrol af en forstærker i nærheden af integration site, der fører til produktion af eGFP i abmeget af Gal4-VP16 produktion. I vores estimat 30-50% af eGFP udtryksbegivenheder skyldes en enhancer fælde og 50-70% skyldes et gen trap 23 (Balciuniene et al. Under udarbejdelse). For at skelne mellem disse to klasser af begivenheder, har vi lavet en 14xUAS: mRFP transgene linie (figur 1B), for nemheds skyld præget af linse-specifik γCry: (. Balciuniene m.fl. under udarbejdelse) GFP. Gene fælde begivenheder er verificerede af co-ekspression af GFP og RFP (sammenlign C og D i figur 2). I vores pilot skærmen, har vi genvundet over 40 gen trap begivenheder efter screening 270 F0 fisk injiceret med en blanding af transposon-DNA og transposase mRNA. To af vores gen fælde integrationer er forekommet i gener med tidligere publicerede kemisk inducerede mutanter: NSF og FLR. De fænotyper af vores insertionelle mutanter NSF tpl6 og flr tpl24 er overfladisk skelnes fra fænotypes af de tilsvarende kemisk inducerede mutanter. Vi bemærkede også, at gen-trap hændelser vises forspændt mod introns nær 5&#39;-enden af ​​gener, hvilket øger sandsynligheden for null alleler. Vi gør observere en vis grad af UAS lyddæmpning (variegation) i alle vores gen fælde linjer, og nogle loci er klart mere modtagelige for variegation end andre. Vi tror ikke, at UAS lyddæmpning er et væsentligt problem for opformering af genet fælde linjer, som vi har været i stand til nemt udbrede alle vores gen fælde linjer gennem mindst fem generationer ved at selektere for GFP udtryk alene.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Store kobling størrelse og ekstern udvikling af optisk transparente embryoner zebrafisk en ekstraordinær hvirveldyr model for in vivo insertionsmutagenese hjælp fluorescerende reportere at mærke ekspression af muterede gener. Adskillige laboratorier har konstrueret og testet forstærker-og gen-trap-vektorer i zebrafisk, ved hjælp af fluorescerende proteiner, Gal4-og lexA-baserede transskriptionsaktivatorer som journalister 1-7. Disse vektorer havde to potentielle ulemper i form af suboptimal stringens (f.eks manglende evne til at skelne mellem forstærker-og gen-trap begivenheder) og lav mutagenicitet (f.eks integrationer til gener sjældent produceret null alleler). Gene Breaking Transposon (GBTs), blev udviklet til at løse disse ulemper 8-10. Vi har ændret et af de første GBT vektorer GBT-R15, til brug med Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter og tilføjede UAS: eGFP som det sekundære reporter for direkte påvisning af gen-trap begivenheder. Anvendelsen af ​​Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter giver to store fordele. For det første øger følsomheden for gener udtrykt ved lave udtryk niveauer. For det andet, at forskerne kan bruge gen fælde linjer Gal4 chauffører direkte udtryk for andre transgener i meget specifikke væv. Dette er især relevant for gener med ikke-essentielle eller overflødige funktioner, hvor gen fælde integration kan ikke resultere i åbenlys fænotyper. Ulempen ved at bruge Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter er, at gener, der koder for proteiner med N-terminale signalsekvenser er ikke modtagelig for fældefangst, som sandsynligvis ikke vil være i stand til at trænge ind i kernen de resulterende Gal4-VP16 fusionsproteiner og aktivere transkription. Vigtigere er det, at anvendelsen af ​​Gal4-VP16 ikke forvælge for kerneproteiner: vi genvundet gen trap mutationer i gener, der koder for proteiner, der fungerer i kernen, cytoplasmaet og plasmamembranen.

I et vellykket injektion, mindst 80% af de embryoner injiceret med genet fælde DNA / Tol2 transposase mRNA blanding vise en vis grad af GFP-fluorescens (figur 3). Når de lyseste GFP-positive embryoner (figur 3C) er udvalgt til at etablere F0 pool, omkring en ud af 10 screenede F0 fisk vil give gen afkom fælde. Blandt de F0 fisk fra hvilket gen fælde begivenheder inddrives, de fleste overfører et enkelt gen fælde arrangement ud over flere ikke-udtrykkende transposonsekvenser integrationer. Imidlertid har vi etableret op til fire gen fælde linjer fra en enkelt F0 individ. GFP / RFP ekspressionsmønstre i gen fælde linjer spænder fra yderst vævsspecifik (f.eks olfaktoriske pærer) til temmelig allestedsnærværende. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figur 1. Than GAL4-holdige todelt genfældevektoren GBT-B1 og dens anvendelsesmuligheder. A. Komponenter i Gal4-holdige genfældevektoren: Tol2 5 &#39;og Tol2 3&#39;, minimal Tol2 transposonenderne 13, CSA, Karpe β-actin splejsningsacceptor 8, ^ Gal4-VP16, Aug mindre Gal4-VP16; zp ( A), zebrafisk β-Actin 3 &#39;UTR og poly (A) elementer fra GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP og SV40 p (A) er komponenter i UAS: eGFP ekspressionskassette 17,18. Pilen angiver aktivering af UAS: eGFP af Gal4-VP16 produceret af genet fælde B. 14XUAS:. MRFP transgen markeret med en linse-specifik γCry: GFP kassette. Pilen angiver aktivering af UAS: mRFP af Gal4-VP16 i trans C. Gene fælde begivenhed.. Blå bokse er exoner. Splejsning er angivet med stiplet linie. D. Enhancer fælde begivenhed. Integration af vektoren i nærheden af ​​en forstærker (brun kasse), kan placere minimal eGFP promotor under kontrol af denne forstærker (brun pil). Dette vil resultere i et væv-specifik ekspression af eGFP, men da Gal4-VP16 ikke sker, vil mRFP udtryk ikke aktiveres. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figur 2. Reversion af gen-fælde begivenheder ved hjælp af Cre rekombinase. A, B. Diagram af et gen fælde mutation (A) og Cre-vendt gen fælde allel (B). C, D. co-ekspression af GFP (C) og RFP (D) i nervesystemet af NSF tpl6 genet fælde linje. E, F. Injektion af Cre RNA i NSF tpl6 embryoner fører til tab af GFP (E) og RFP (F) udtryk. Bemærk, at der er ingen reduktion i GFP-ekspression i linsen, som forventet. Figur 3. Embryoner injiceret med GBT-B1 (pDB783)-gen fælde. . A. Embryoner injiceres med pGBT-B1 (pDB783) alene display lille GFP-fluorescens i kroppen B, C. Embryoner injiceret med pGBT-B1 og Tol2 transposasen mRNA: en tilfældig gruppe af embryoner (B) og høj-ekspressorer udvalgt til opdræt (C). <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figur 4.. Eksperimentel skitse for etablering af Gal4 gen fælde linjer. Delvist overlappende rød / grøn strukturer indikerer co-ekspression af GFP og RFP, mens grøn alene viser mosaicisme til gen fælde eller forstærker fælde begivenheder.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Denne protokol beskriver metoden til gen fælde insertionsmutagenese hjælp Gal4-VP16 som den primære reporter og GFP / RFP som sekundære journalister i zebrafisk. Omkring én ud af ti højt udtrykker F0 fisk udbytte gen afkom fælde co-udtrykker GFP og RFP. Screeningsproceduren kan let skaleres til at tilpasse størrelsen af ​​det laboratorium, der udfører den insertionsmutagenese skærmen.

Gene Trapping Brug Gal4 i zebrafisk

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporation af Morpholinos i den voksne zebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering af ribo Bundet Gryende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; Til at identificere Translationelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Brug SecM Arrest Sequence som et redskab til at isolere ribo bundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inden Zebrafisk embryoner at studere genekspression og funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Voksen Zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...