Name: gene trapping using gal4 in zebrafish
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Vi takker Dr. Jennifer Emtage for kritisk lesing av manuskriptet, Ryan Gill for teknisk assistanse og hjelp med sebrafisk omsorg og Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) for reagenser. Vårt arbeid har vært støttet av Temple University College of Science and Technology og National Institutes of Health (R01-HD061749).

En. Produksjon av F0 generasjonen av Mikroinjeksjon av Gene Trap. Vi har funnet ut at embryoer fra ulike genetiske bakgrunn vise ulike toleranser til denne prosedyren, med kjæledyrbutikk basert villtype og Tübingen - Long Fin (TLF) er den mest tolerante mens AB og Tuebingen stammer har dårligere overlevelse. <ol><li> Utarbeidelse av transposon DNA. Forbered GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. Under forberedelse) plasmid DNA ved hjelp av standard QIAprep miniprep kit (Qiagen 27106). Det er viktig å inkludere PB vasketrinn (som er valgfrie i fremgangsmåten QIAprep), ellers miniprep DNA vil bli forurenset av RNase A, som fører til nedbrytning av transposase mRNA. Før injeksjon, fortynne DNA i RNase-fritt vann (Ambion AM9937) til 10 ng / mL. </li><li> Utarbeidelse av transposase mRNA. Linear pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 bruker Xbal og transkribere lineært DNA ved hjelp av en mMessage Machine T3(Ambion AM1348) in vitro transkripsjon kit. Vi har modifisert in vitro transkripsjon reaksjonen ved å tilsette 0,5 mL av RiboLock RNase inhibitor (Thermo Fermentas EO0381). Etter DNase behandling skritt, rense mRNA ved hjelp av en RNeasy MinElute kit (Qiagen 74204). Vurdere kvaliteten av in vitro-transkribert mRNA ved agarose-gel-elektroforese. Fortynne mRNA i RNase-fritt vann til 40 ng / mL, og butikken som 2 ul delprøver ved -80 ° C. </li><li> Fremstilling av mikroinjeksjon blanding. Før injeksjon, tilsett 8 pl av fortynnet transposon DNA til en 2 mL alikvot av transposase mRNA. </li><li> Mikroinjeksjon. Injisere tre nl av DNA / RNA blandingen i plommen i en celle sebrafisk embryo ved hjelp av standard mikroinjeksjon teknikker, sikter til plommen / blastomere grensesnitt. Samle embryoer hver 20 min for å sikre injeksjon på en celle stadiet. I vår erfaring, kan en dyktig person lett injisere 1000 fostre i 1-1,5 time. </li><li> Etter injeksjon, kjøre 5 mL av venstreløpet av injeksjonsoppløsning på en 1% agarosegel for kvalitetskontroll for å sikre at transposase mRNA ikke er blitt forringet. </li><li> Injisert embryo omsorg. I sen ettermiddag, fjerne ubefruktede og unormale embryoer og distribuere embryoer til 60-80 per 100 mm petriskål. Unormale og døde embryoer blir fjernet på en dag etter befruktning (DPF), 2 dpf og tre dpf. </li><li> Screening for GFP uttrykk. Skjerm embryo uten åpenlys feil for GFP fluorescens ved tre dpf (figur 3). Screening kan gjøres enten på et stereomikroskop utstyrt med fluorescens (vi bruker Nikon et SMZ1500) eller på en oppreist mikroskop (vi bruker en Zeiss AxioImager med en 5X Fluar objektiv). Lav GFP uttrykk indikerer enten mislykket injeksjon eller degradering av transposase RNA grunn RNase forurensning (figur 3A). Velg omtrent 30% av de skarp embryoer som enten GFP ekspresjon i flere vev eller i en høy prosentandel av celler i et spesifikt vev (sammenlign Figures 3B og 3C). Fra en injeksjon av 1000 embryoer, vi har vanligvis opptil 100 utviklingshemmede-normal, høy-GFP-uttrykke embryoer. </li><li> Hev utvalgte F0 embryoer ved hjelp av standard sebrafisk oppdrettsprosedyrer. Det er rimelig å forvente at 20-30% av de injiserte embryoer valgt for oppdrett vil overleve til voksen alder. </li></ol> 2. Vedlikehold av UAS: mRFP Tester Linje. Vi har generert en 14xUAS: mRFP linjen preget av linse-spesifikke γCry: GFP. Siden UAS er gjenstand for demping gjennom DNA-metylering, er det viktig å velge fisk med lave nivåer av stanse å forplante lager. <ol><li> Sett opp individuelle UAS: mRFP homozygoter for parring med en av våre mest pålitelige Gal4 genet felle linjer, NSF tpl6 (Balciuniene m.fl. under utarbeidelse.). </li><li> På den neste dagen, overføre UAS: mRFP fisk som ga embryoer til individuelle statiske tanker, mens embryoene er samletog rengjøres. </li><li> Skjerm embryoer for GFP og RFP fluorescens ved en dpf og tre dpf. </li><li> Intercross fisk som ga embryoer med høy mRFP uttrykk for å etablere neste generasjon av UAS: mRFP linje. </li></ol> Tre. Screening av F0 Fish. <ol><li> Kryss individuell F0 med homozygot UAS: mRFP fisk (figur 4). Vi pleier å injisere våre GBTs inn linjer med villtype eller leopard pigmentering mønstre, og våre homozygote UAS: mRFP linjen er i messing bakgrunn. Derfor GBT-injisert F0 fisk kan være lett skilles fra de UAS: mRFP fisk, noe som eliminerer behovet for å registrere om det F0 blir screenet var en mann eller en kvinne, så vel som potensielle feil som skyldes feil i opptak og / eller bestemme kjønn hver fisk. Personell med svært begrenset erfaring, som oss studentene, er derfor i stand til å sette opp og bryte ned fiskeparringer. Denne tilnærmingen har en ulempe at to ulike genetiske bakgrunn erblir brukt, potensielt kompliserer tolkningen av tap av funksjon fenotyper. </li><li> På den neste dagen, tilbake messing UAS: mRFP fisk til sin tank. Plasser F0 fisk som ga embryoer i individuelle statiske tanker (vi bruker Hagen Exo Terra Faunarium Liten, men enhver liten tank kan brukes til dette formålet) mens embryoer blir innsamlet og skjermet. </li><li> Rene og overføre innsamlede embryoer til nye petriskåler (&lt;100 per parabol) på ettermiddagen dagen 0. </li><li> Skjerm embryoer for GFP og RFP fluorescens ved en dpf, 2 dpf og tre dpf. Trekk embryoer positive for både GFP og RFP ut, sortere dem etter GFP / RFP uttrykk mønster (hvis mer enn ett mønster er observert i en clutch) og oppdra dem til å etablere F1-generasjonen. </li><li> Avlive F0 fisk som produseres bare negative embryoer (av et totalt antall på 50-100 embryoer). </li><li> Kryss F0 fisk som produseres GFP / RFP-positive avkom igjen for å få en ny gruppe med positive. </li></ol> 4.Screening av F1 fisk. F1 fisk er skjermet for å etablere F2 familier, for å dokumentere genet felle uttrykk mønster og å fryse grupper av embryoer for molekylær identifisering av genet felle loci ved 5 &#39;RACE og invers PCR. <ol><li> Kryss individuell F1 fisk med homozygot UAS: mRFP fisk (figur 4). </li><li> Neste dag, plasserer F1 fisk som ga embryoer i individuelle statiske tanker mens embryoene er samlet og skjermet. </li><li> Skjerm embryoer for GFP og RFP fluorescens ved en dpf, 2 dpf og tre dpf. Separate og fotografere embryoer positive for både GFP og RFP 24. </li><li> På fem dpf, fryse grupper av 20 GFP / RFP-positive og 20 GFP / RFP-negative embryoer for identifisering av insertionally muterte gener ved invers PCR og 5 &#39;RACE 9,10. Hev gjenværende GFP / RFP-positive embryoer å etablere F2 generasjon. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

Disse forfatterne har ingenting å avsløre.

Genet felle vektorer og metodikk som er beskrevet her brukes allerede i flere uavhengige laboratorier. I vår erfaring, er det to kritiske trinn i prosessen. Den første kritiske trinnet er å oppnå høy forekomst av genet felle integrering i injisert F0 embryoer. Svikt på dette trinnet kan ofte tilskrives RNase forurensning av injeksjons reagenser, spesielt miniprep DNA. Det er også meget viktig å injisere embryoer ved en cellestadiet for genet felle eksperimenter. I vår erfaring, er Tol2-mediert transgenesis svært effektiv, noe som gjør det mulig å få transgene linjer selv når injisere senere enn en celle scenen eller med lavere kvalitet DNA. Substandard injeksjoner er mye mer problematisk når man utfører genet felle mutagenese, siden bare en liten brøkdel av vektorintegras resultere i effektive genet felle arrangementer. Den andre kritiske trinnet er å fastslå genet felle hendelser ved krysset til vår UAS: mRFP linje. Fravær av mRFP uttrykk ernesten alltid en indikasjon på en enhancer-felle event. Men noen ganger mangel på mRFP uttrykk kan tyde stanse av de 14x UAS. Det er derfor viktig å opprettholde de UAS: mRFP linje i et ikke-Silenced tilstand ved å spre den neste generasjonen bruker personer med høy RFP uttrykk når krysset til NSF tpl6. Vi kan forutse å gjøre flere forbedringer til våre genet felle vektorer og protokoll. Den første er å bruke en mindre repeterende UAS i genet felle konstruere. Det har vist seg at en 5 x UAS er tilstrekkelig for å oppnå fullstendig aktivering i cellekultur eksperimenter, og at mindre repetitive sekvenser UAS er mindre utsatt for metylering og stanse 6,25. Det kan også være mulig å utforme genet felle vektorer for fullt betinget mutagenese, i analogi til de vektorer som brukes av den internasjonale mus genet felle konsortiet og nylig tilpasset for sebrafisk 2,26,27. En annen forbedring ville være å bruke en annen transposon system, for eksempel Tornerose 28, for å generere et UAS: mRFP reporter linje. Dette ville gjøre det mulig injeksjon av Tol2-baserte genet feller direkte inn reporteren linje og screening av F0s ved incrossing. Videre vil dette eliminere bruken av to ulike genetiske bakgrunn, noe som gjør tolkningen av tap av funksjon fenotyper mer ukomplisert. Selv med disse forbedringene, ville den generelle Gal4 genet felle protokoll som presenteres her fortsatt være fullt brukbar.

Innsettingen mutagenese har vist seg å være en kraftig tilnærming til dissekere gen-funksjon i ulike modellsystemer fra encellede organismer som bakterier og gjær til flercellede organismer som mus og planter. Enhver eksogen DNA (virus, transposon eller plasmid) kan tjene som et mutagen ved å avbryte vesentlige deler av gener som eksoner eller promotorer. Den effektive målet for slike enkle metoder er meget små i store komplekse genomer, for eksoner omfatter bare 1-3% av en typisk virveldyr genom. Liten effektiv målet størrelse kan overvinnes ved svært høy vektorintegrasjons priser, eksemplifisert ved den enorme suksessen til retrovirale innsettingen mutagenese i sebrafisk 11,12. I motsetning til dette introner omfatter omtrent 20 til 30% av hvirvel-genomer. I sebrafisk, transposon basert innsettingen mutagenese vektorer som effektivt innføre null-eller alvorlige hypomorphic mutasjoner ved integrering i introner har fått navnet &quot;genet bryte transposons &quot;(GBTs) 8-10. For effektiv genet felle integrering, de bruker en minimal Tol2 transposon 13,14. Mutagenisitet av GBTs er avhengig av fisk-avledet spleise akseptor og transkripsjons oppsigelse / polyadenylerings sekvenser. Elementene som er ansvarlige for GBT mutagenisitet er flankert ved direkte loxP nettsteder for eksisjon av Cre recombinase. Dermed injeksjon av Cre mRNA fører til effektiv tilbakeføring av GBT-induserte mutasjoner, selv om noen transposon sekvenser ligge på integrering locus 9,10. De nylig publiserte GBT vektorer bruke mRFP som genet felle reporter 9,10, noe som fører til to potensielle svakheter. For det første er det ikke kjent hvilken del av sebrafisk gener uttrykkes på et høyt nok nivå til å bli detektert ved direkte fluorescerende reporter fusjonsproteiner. For det andre, blir bare en liten del av gener som forventes å ha viktige funksjoner. Det har blitt anslått at det bare er 1,400-2,400 gener som kreves for sebrafisk Nymcnt 15,16. De fleste genet felle mutanter er ikke forventet å vise åpenlys fenotyper og derfor vil ha begrenset nytte. For å overvinne disse to begrensninger, har vi endret GBT-R15 9,10 å bruke med Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter (Balciuniene et al. Under forberedelse). Som med august-mindre mRFP i GBT-R15, ble oversettelsen startwebstedet fjernet fra Gal4-VP16. For direkte påvisning av genet felle hendelser, våre vektorer inneholde en eGFP reporter under kontroll av 14x Gal4 UAS 17,18. Flere andre funksjoner er manipulert inn i vår bipartite genet felle vektor. UAS: eGFP kassett er flankert av direkte FRT nettsteder (grå Sparrer i figur 1). Injeksjon av Flp recombinase mRNA fører til eksisjon av UAS: eGFP kassett, forlater genet felle mutasjon umarkert ved eGFP fluorescens. Det kan da brukes i transgene linjer som markerer bestemte vev eller utviklings hendelser ved GFP fluorescens. Som i andreGBTs, er hele genet felle kassett flankert av direkte loxP sider (åpne pentagoner i figur 1). Dette gjør genet felle hendelser reversibel ved ekspresjon av Cre rekombinase, lett etablere bevis på årsaksforholdet mellom et bestemt gen felle integrering og observert fenotype (Fig. 2). Til slutt, er det genet felle kassett flankert av inverterte I-SCEI meganuclease sider (svarte trekanter i figur 1). I Drosophila, er transposon integrasjoner ofte konvertert til slettinger (mangel) ved upresis excision av P element. Det er ingen bevis for at eksisjon av Tol2 transposon (eller hvilken som helst annen transposon aktiv i virveldyr som Sleeping Beauty, PiggyBac eller Ac / Ds) kan føre til sletting. Vi følger derfor I-SCEI nettsteder som en potensiell surrogat metode for induksjon av slettinger, selv om det ikke er noen bevis på at jeg-SCEI kan indusere slettinger i sebrafisk. Det bør bemerkes at mens jeg-SCEI meganuklease kan brukes for å lette transgenesis i zebrafisk, blir DNA-spalting av I-SCEI meganuclease brukes til å studere DNA-reparasjonsmekanismene, herunder utsatt for feil ikke-homolog ende sammenføyning, i gjær-og pattedyrceller 19-22. Integrering av vår genet felle vektor kan føre til eGFP uttrykk ved to forskjellige mekanismer. Den første er en sann gen felle arrangement (figur 1C): vektoren integreres i et gen (IMG for Insertionally muterte genet), en fusjon transkripsjon mellom 5 &#39;av det endogene IMG transkripsjon og Gal4-VP16 er laget og oversatt til en fusjonsprotein som inneholder den N-terminus av proteinet kodet for av IMG og Gal4-VP16. Dette fusjonsprotein binder til den 14x UAS og aktiverer transkripsjon av eGFP. Den andre, mindre ønskelig hendelse er en enhancer-felle (fig. 1D): den minimale promoter foran eGFP faller under kontroll av en enhancer ved integrering side, som fører til produksjon av eGFP i abfølelse av Gal4-VP16 produksjon. I vår anslag, 30-50% av EGFP uttrykk arrangementer er på grunn av en enhancer felle og 50-70% er på grunn av et gen-felle 23 (Balciuniene et al. Under forberedelse). For å skille mellom disse to klasser av hendelser, har vi gjort en 14xUAS: mRFP transgen linjen (figur 1B), for enkelhets preget av linse-spesifikke γCry: (. Balciuniene et al i forberedelse) GFP. Gene felle hendelser er verifisert av co-uttrykk for GFP og RFP (sammenligne C og D i figur 2). I vår pilotskjermen, vi gjenvunnet over 40 genet felle hendelser etter screening 270 F0 fisk injisert med en blanding av transposon DNA og transposase mRNA. To av våre genet felle integrasjoner har skjedd i gener med tidligere publiserte kjemisk-indusert mutanter: NSF og FLR. De fenotyper av vår innsett mutanter NSF tpl6 og flr tpl24 er overfladisk skilles fra fenotypes av de tilsvarende kjemisk-indusert mutanter. Vi observerte også at genet felle hendelser vises forspent mot introner nær 5 &#39;enden av genene, og dermed øker sannsynligheten for null-alleler. Vi gjør observere en viss grad av UAS stanse (variegation) i alle våre genet felle linjer, og noen loci er klart mer utsatt for vekslande enn andre. Vi tror ikke at UAS lyddemping er et betydelig problem for spredning av genet felle linjer, som vi har vært i stand til enkelt å forplante alle våre genet felle linjer gjennom minst fem generasjoner ved å velge for GFP uttrykk alene.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Stor kullstørrelse og ekstern utvikling av optisk gjennomsiktig embryo gjør sebrafisk en eksepsjonell virveldyr modellsystem for in vivo innsettingen mutagenese ved hjelp av fluorescerende journalister å tagge uttrykk av muterte gener. Flere laboratorier har konstruert og testet enhancer-og gen-felle vektorer i sebrafisk, ved hjelp av fluorescerende proteiner, Gal4-og Lexa-baserte transkripsjonsaktivatorer som journalister 1-7. Disse vektorene hadde to mulige ulemper: suboptimal stringens (f.eks manglende evne til å skille mellom enhancer-og gen-felle hendelser) og lav mutagenisitet (f.eks integrasjoner i genene sjelden produsert null alleler). Gene Breaking transposon (GBTs) ble utviklet for å møte disse ulempene 8-10. Vi har modifisert av en av de første GBT vektorer, GBT-R15, for bruk med Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter og lagt UAS: eGFP som sekundær reporter for direkte påvisning av genet felle arrangementer. Application av Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter gir to fordeler. Først, det øker følsomheten for gener uttrykt på lave nivåer. For det andre gjør det forskere å bruke genet felle linjer som Gal4 drivere til direkte uttrykk for andre transgener i svært spesifikke vev. Dette er spesielt relevant for gener med ikke-essensielle eller overflødige funksjoner der genet felle integrering ikke kan resultere i overt fenotyper. Ulempen ved å bruke Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter er at gener som koder for proteiner med N-terminal signalsekvenser er ikke mottagelig for fangst, som de resulterende Gal4-VP16 fusjonsproteiner er trolig ikke være i stand til å gå inn i cellekjernen og aktivere transkripsjon. Viktigere er bruken av Gal4-VP16 ikke pre-selektere for kjerneproteiner: vi gjenvunnet genet felle mutasjoner i gener som koder for proteiner som virker på kjernen, cytoplasma og plasmamembranen.

I en vellykket injeksjon, i hvert fall 80% av embryoer injisert med den gene-felle DNA / Tol2 transposase mRNA blanding vise en viss grad av GFP fluorescens (figur 3). Når de skarp GFP-positive embryoer (Figur 3C) er valgt til å etablere F0 bassenget, om lag én av ti skjermet F0 fisk vil gi genet felle avkom. Blant F0 fisk fra hvilket gen felle hendelser er gjenopprettet, de fleste sender et enkelt gen felle hendelsen i tillegg til flere ikke-uttrykker transposon integrasjoner. Men, har vi etablert opptil fire genet felle linjer fra en enkelt F0 individ. GFP / RFP uttrykk mønstre i genet felle linjer varierer fra ekstremt vev spesifikke (for eksempel i olfactory pærer) til ganske allestedsnærværende. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figur 1. Than Gal4 holdig bipartite genet felle vektor GBT-B1 og dets applikasjoner. A. Komponenter i Gal4 holdige genet felle vektor: Tol2 5 &#39;og Tol2 3&#39;, ender minimal Tol2 transposon 13, CSA, Karpe β-Actin spleise akseptor 8; ^ Gal4-VP16, Aug-mindre Gal4-VP16, zp ( A), sebrafisk β-Actin 3 &#39;UTR og poly (A) elementer fra GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP og SV40 p (A) er komponenter av UAS: eGFP ekspresjonskasett 17,18. Pilen indikerer aktivering av UAS: eGFP av Gal4-VP16 produsert av genet felle B. 14XUAS:. MRFP transgenet preget av en linse-spesifikke γCry: GFP kassett. Pilen indikerer aktivering av UAS: mRFP av Gal4-VP16 i trans C. Gene felle hendelsen.. Blå boksene er eksoner. Spleising er angitt med stiplet linje. D. Enhancer felle hendelsen. Integrasjon av vektoren i nærheten av en enhancer (brun boks) kan plassere den minimale eGFP promoteren under kontroll av dette enhancer (brun pilen). Dette vil resultere i en vev-spesifikke uttrykk for eGFP, men siden Gal4-VP16 ikke er gjort, ville mRFP uttrykk ikke aktiveres. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figur 2. Hjemfall av genet felle hendelser ved hjelp Cre recombinase. A, B. Diagram av et gen felle mutasjon (A), og Cre-genet tilbakestilt felle allele (B). C, D. Co-ekspresjon av GFP (C) og RFP (D) i nervesystemet i nsf tpl6 gen felle linje. E, F. Injeksjon av Cre RNA til nsf tpl6 embryoer fører til tap av GFP (E) og RFP (F) uttrykk. Legg merke til at det ikke er noen reduksjon av GFP ekspresjon i linsen, som forventet. Figur 3. Embryoet injisert med GBT-B1 (pDB783) genet felle. . A. embryo injisert med pGBT-B1 (pDB783) alene skjerm lite GFP fluorescens i kroppen B, injisert med pGBT-B1 og Tol2 transposase mRNA C. embryo: en tilfeldig gruppe av befruktede egg (B) og høy-expressors valgt for oppdrett (C). <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figur 4. Eksperimentell disposisjon for etablering av Gal4 genet felle linjer. Delvis overlappende rød / grønne strukturer indikerer co-uttrykk for GFP og RFP, mens grønt alene indikerer mosaicism for genet felle eller enhancer felle hendelser.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Denne protokollen beskriver metoden av genet felle innsettingen mutagenese ved hjelp Gal4-VP16 som den primære reporter og GFP / RFP som sekundære journalister i sebrafisk. Omtrent én av ti high-uttrykke F0 fisk avkastning genet felle avkom co-uttrykker GFP og RFP. Screeningfremgangsmåten kan lett skaleres til å tilpasse seg størrelsen på laboratoriet utfører innsettingen mutagenese skjermen.

Gene Fangst Bruke Gal4 i sebrafisk

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo electroporation av Morpholinos til Adult sebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Høy oppløsning Whole Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering innenfor sebrafisk embryoer å studere Gene Expression og funksjon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult Sebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...