Name: gene trapping using gal4 in zebrafish
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Мы благодарим доктора Дженнифер Emtage за критическое прочтение рукописи, Райан Гилл для оказания технической помощи и помочь с данио помощи и д-р Стивен С. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Миннесота) для реагентов. Наша работа была поддержана Храмовой Университетского колледжа науки и техники и Национального института здоровья (R01-HD061749).

1. Производство F0 поколения микроинъекцией гена Trap. Мы обнаружили, что эмбрионы различных генетических фонов отображать различные допуски к этой процедуре, с домашними магазине дикого типа и Тюбинген - Длинные Фин (TLF) является наиболее терпимая а AB и Тюбинген штаммы имеют более низкий уровень выживания. <ol><li> Подготовка транспозонов ДНК. Подготовка GBT-B1 (pDB783, Balciuniene соавт. В стадии подготовки) ДНК плазмиды с использованием стандартного QIAprep минипрепаративного набора (Qiagen 27106). Важно, чтобы включать в себя стадию стирки Pb (который является необязательным в процедуре Qiaprep), в противном случае ДНК минипрепаративную будут загрязнены РНКазы А, что приводит к деградации мРНК транспозазы. Перед инъекцией, разбавить ДНК в РНКазы свободной воды (Ambion AM9937) до 10 нг / мкл. </li><li> Подготовка транспозазы мРНК. Линеаризуем pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 с помощью XbaI и транскрибировать линеаризованную ДНК с использованием mMessage машина T3(Ambion AM1348) в пробирке комплекте транскрипции. Мы модифицировали реакцию в пробирке транскрипции, добавив 0,5 мкл ингибитора RiboLock РНКазы (ThermoFisher Fermentas EO0381). После стадии обработки ДНКазой, очистить мРНК с использованием набора RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Оценка качества в пробирке транскрибируется мРНК путем электрофореза в агарозном геле. Развести мРНК в РНКазы свободной воды до 40 нг / мкл, и хранить как 2 мкл аликвоты при -80 ° С. </li><li> Подготовка микроинъекции смеси. Перед инъекцией, добавить 8 мкл разведенной транспозонов ДНК к 2 мкл аликвоты транспозазы мРНК. </li><li> Микроинъекция. Введите 3 нл ДНК / РНК смеси в желток 1 эмбрионов данио клеток с использованием стандартных методов микроинъекции, направленный для интерфейса желток / бластомеров. Сбор эмбрионов каждые 20 минут, чтобы обеспечить инъекции на 1 этапе клетки. По нашему опыту, искусный человек может легко вводить 1000 эмбрионов в 1-1,5 часа. </li><li> После инъекции, запустить 5 мкл слеванад инъекционного раствора на 1% агарозном геле для контроля качества, чтобы гарантировать, что транспозаза мРНК не ухудшается. </li><li> Введенный уход эмбрион. В конце дня, удалить неоплодотворенные и аномальные эмбрионы и распространять эмбрионов до 60-80 на 100 мм чашки Петри. Аномальные и мертвые эмбрионы удаляются на 1 день после оплодотворения (DPF), 2 денье и 3 денье. </li><li> Скрининг выражения GFP. Эмбрионы экран без явных дефектов для GFP флуоресценции при 3 DPF (рис. 3). Скрининг может быть сделано либо на стереомикроскопа, снабженного флуоресценции (мы используем Nikon SMZ1500) или на прямой микроскоп (мы используем Zeiss AxioImager с целью 5X Fluar). Низкий выражение GFP указывает на неудачную инъекцию или деградации транспозазы РНК из-за загрязнения РНКазы (рис. 3а). Выбрать около 30% наиболее ярких эмбрионов, которые либо имеют выражение GFP во многих тканях или в высоком проценте клеток специфической ткани (сравните Figures 3В и 3С). От инъекции 1000 эмбрионов, мы обычно имеем до 100 умственно-Normal, High-GFP-экспрессирующих эмбрионов. </li><li> Поднять выбранные эмбрионы F0, используя стандартные процедуры данио воспитания. Разумно ожидать, что 20-30% из введенных эмбрионов, отобранных для выращивания доживет до совершеннолетия. </li></ol> 2. Уход за БАС: MRFP тестер линии. Мы сформировали 14xUAS: MRFP линия отмечена объектива конкретных γCry: GFP. С БАС подлежит глушителей через метилирование ДНК, важно, чтобы выбрать рыбу с низким уровнем глушителей для распространения акций. <ol><li> Установите отдельный UAS: MRFP гомозигот по спаривания с одним из наших самых надежных Gal4 ген ловушки линий, NSF tpl6 (Balciuniene др. в стадии подготовки.). </li><li> На следующий день, передавать UAS: MRFP рыбы, которые давали эмбрионов отдельных стационарных цистерн, в то время как эмбрионы собраныи очистить. </li><li> Эмбрионы сетчатые для GFP и RFP флуоресценции на 1 DPF и 3 DPF. </li><li> Интеркросс рыба, которая дала эмбрионов с высокой экспрессией MRFP установить следующее поколение БАС: MRFP линии. </li></ol> 3. Скрининг F0 рыбы. <ol><li> Крест индивидуальный F0 с гомозиготной БАС: MRFP рыбы (рис. 4). Мы обычно вводят наши ГБЦ в линиях с дикого типа или леопарда пигментации моделей, и наши гомозиготные БАС: MRFP линия находится в латунной фоне. Поэтому ББТ впрыском F0 рыба может быть легко отличить от БАС: MRFP рыбы, что исключает необходимость для записи, был ли F0 проходит проверку мужчина или женщина, а также потенциальные ошибки, возникающие в результате ошибок в записи и / или определяющих пол каждая рыба. Персонал с очень ограниченным опытом, таких нас студентов, поэтому в состоянии установить и сломать рыбы вязки. Этот подход имеет тот недостаток, что два разных генетических фонов являютсяиспользуется, потенциально осложняет интерпретацию потери функциональных фенотипов. </li><li> На следующий день, вернуться медные UAS: MRFP рыбу их танк. Поместите F0 рыбу, которая дала эмбрионов в отдельных стационарных цистерн (мы используем Hagen Exo Terra Faunarium Маленький, но любой небольшой резервуар может быть использован для этой цели), а эмбрионы были собраны и экранированы. </li><li> Чистые и передачи собранных эмбрионов в новые чашки Петри (&lt;100 за блюдо) во второй половине дня в день 0. </li><li> Эмбрионы сетчатые для GFP и RFP флуоресценции на 1 денье, 2 денье и 3 DPF. Потяните эмбрионов положительные как для GFP и RFP вне, сортировать их по GFP / RFP паттерна экспрессии (если более одного картина наблюдается в кладке) и поднять их установить F1 поколения. </li><li> Усыпить F0 рыбу, которая производится только отрицательные эмбрионов (из общего числа 50-100 эмбрионов). </li><li> Крест F0 рыбу, которая производится GFP / RFP-положительных потомство снова, чтобы получить вторую партию срабатываний. </li></ol> 4.Скрининг F1 рыбы. Рыба F1, проверяются установить F2 семьи, к документу генной ловушки паттерн экспрессии и заморозить партии эмбрионов для молекулярной идентификации гена ловушки локусов на 5 &#39;RACE и обратной ПЦР. <ol><li> Крест отдельных рыб F1 с гомозиготной БАС: MRFP рыбы (рис. 4). </li><li> На следующий день, поместите рыбу F1, который дал эмбрионов в отдельных стационарных цистерн в то время как эмбрионы собирают и просеивают. </li><li> Эмбрионы сетчатые для GFP и RFP флуоресценции на 1 денье, 2 денье и 3 DPF. Отдельные и сфотографировать эмбрионы положительные как для GFP и RFP 24. </li><li> В 5 DPF, заморозить партии 20 GFP / RFP-положительных и 20 GFP / RFP-отрицательных эмбрионов для идентификации insertionally мутировавших генов с помощью обратной ПЦР и 5 &#39;RACE 9,10. Поднимите оставшиеся GFP / RFP-положительных эмбрионов установить F2 поколения. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

Эти авторы не имеют ничего раскрывать.

В генной ловушки векторы и методология, описанные здесь, уже используются в нескольких независимых лабораториях. По нашему опыту, есть два важных шагов в этом процессе. Первый важный шаг состоит в достижении высоких темпов интеграции ген ловушки в введенных эмбрионов F0. Невыполнение на этом этапе часто можно отнести к РНКазы загрязнения впрыска реагентов, особенно ДНК минипрепаративную. Кроме того, очень важно, чтобы придать эмбрионов на стадии 1 клеток для генной ловушки экспериментов. По нашему опыту, Tol2-опосредованной трансгенез очень эффективно, что делает возможным получение трансгенных линий даже при введении позднее стадии 1 клеток или с более низким качеством ДНК. Нестандартные инъекции намного более проблематичным при проведении генной ловушки мутагенеза, так как только небольшая часть векторных интеграции привести к эффективной событий генной ловушки. Второй критический этап заключается в выяснении генной ловушки событий путем скрещивания в наш БАС: MRFP линии. Отсутствие выражения MRFP являетсяпочти всегда свидетельствует о событии усилитель ловушки. Однако, иногда отсутствие экспрессии MRFP может указывать молчание на 14x БАС. Поэтому важно поддерживать UAS: MRFP линии в не замолчать государства путем распространения нового поколения с использованием лиц с выражением высокого RFP, когда подошел к NSF tpl6. Мы можем предвидеть делая несколько улучшений для наших генов ловушки векторов и протокол. Первый состоит в использовании менее повторяющиеся UAS в генной ловушки конструкции. Было показано, что 5x UAS является достаточным для достижения полной активации в экспериментах культуре клеток, и что менее повторяющиеся последовательности UAS менее восприимчивы к метилирования и глушителей 6,25. Он также может быть возможно конструировать векторы генной ловушки для полностью условного мутагенеза, по аналогии с векторами, используемых в международной мыши ген ловушки консорциума и недавно приспособленных для данио 2,26,27. Еще одним усовершенствованием будет использовать другую тransposon система, например Спящая красавица 28, для создания UAS: MRFP репортер линии. Это позволило бы инъекцию генов ловушек Tol2 основе непосредственно в репортера линии и скрининга F0s по incrossing. Кроме того, это было бы отказаться от использования двух различных генетических предпосылок, что делает толкование потери функциональных фенотипов более простым. Даже с этими улучшения, общая Gal4 ген ловушка Протокол, представленные здесь все равно будет в полной мере применимы.

Инсерционного мутагенеза оказалась мощным подход к рассекает функции генов в различных модельных системах от одноклеточных организмов, таких как бактерии и дрожжи, чтобы многоклеточных организмов, таких как мыши и растений. Любой экзогенный DNA (вирус, транспозона или плазмида) может служить в качестве мутагена, прерывая основные элементы генов, таких как экзонов или промоторов. Эффективная цель таких простых подходов чрезвычайно мала в больших сложных геномов, так как экзоны составляют лишь 1-3% от типичной позвоночных геном. Малый эффективный размер мишени могут быть преодолены очень высокая векторных ставок интеграции, о чем свидетельствует огромный успех ретровирусов инсерционного мутагенеза в данио 11,12. В противоположность этому, интроны включают приблизительно 20-30% геномах позвоночных. У рыбок данио транспозонов основе инсерционных мутагенеза векторов, которые эффективно ввести нуль-или серьезные гипоморфных мутации при интегрировании в интронов были названы &quot;ген нарушая transposoнс &quot;(ГБЦ) 8-10. Для эффективной интеграции ген ловушки, они используют минимальное Tol2 транспозон 13,14. Мутагенность ГБЦ полагается на рыб, полученных сращивания акцептора и транскрипционных последовательностей прекращение / полиаденилирования. Элементы, ответственные за ББТ мутагенность фланкированы на прямых участках LoxP для удаления по Cre рекомбиназы. Таким образом, инъекции Cre мРНК приводит к эффективному реверсии GBT-индуцированных мутаций, хотя некоторые транспозонов последовательности остаются в локусе интеграции 9,10. Недавно опубликованные векторы ББТ использовать MRFP как ген ловушки репортера 9,10, что приводит к двух потенциальных недостатков. Во-первых, не известно, какая часть данио генов экспрессируются на достаточно высоком уровне, чтобы быть обнаружены путем прямых флуоресцентных белков репортер синтеза. Во-вторых, только небольшое подмножество генов, как ожидается, имеют существенные функции. Было подсчитано, что есть только 1,400-2,400 гены, необходимые для рыбок данио Developmeнт 15,16. Большинство генов ловушки мутанты не ожидается проявляют явных фенотипы и поэтому будет иметь ограниченное применение. Чтобы преодолеть эти два ограничения, мы изменили GBT-R15 9,10 для использования с Gal4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортера (Balciuniene и соавт. В стадии подготовки). Как и АВГ-менее MRFP в ББТ-R15, начало перевод сайта был удален из Gal4-VP16. Для прямого обнаружения гена ловушки событий, наши векторы содержат корреспонденту EGFP под контролем 14x Gal4 БАС 17,18. Несколько дополнительных функций разработаны в нашей двустороннего вектора генной ловушки. УАС: EGFP кассета в окружении прямых участках FRT (серые стрелки на рисунке 1). Инъекция Flp рекомбиназы мРНК приводит к удалению из БАС: EGFP кассеты, оставив генной ловушки мутацию Снята по флуоресценции EGFP. Затем он может быть использован в трансгенных линий, которые обозначают конкретные ткани или события в развитии от флуоресценции GFP. Как и в другихГБЦ, весь ген ловушка кассета в окружении прямых участках LoxP (открытые пятиугольники на рисунке 1). Это делает ген ловушки события обратимы экспрессией Cre рекомбиназы, легко установить доказательство причинности отношений между определенной интеграции ген ловушки и наблюдается фенотип (рис. 2). Наконец, ген ловушка кассета окружении перевернутых Я-SCEI meganuclease сайтов (черные треугольники на рисунке 1). У дрозофилы транспозонов интеграции часто превращается в удалений (недостатков) по неточной иссечения P элемента. Там нет никаких доказательств, что иссечение Tol2 транспозон (или любой другой транспозон активного у позвоночных, таких как Спящая красавица, PiggyBac или AC / DS) может привести к удалений. Поэтому мы включены I-SCEI сайтов как потенциальной суррогатной метод индукции удалений, хотя нет никаких доказательств, что я-SCEI может вызвать удаление у рыбок данио. Следует отметить, что в то время как I-SCEI мегануклеазы могут быть использованы для облегчения трансгенеза у рыбок данио, расщепление ДНК I-SCEI meganuclease используется для изучения механизмов репарации ДНК, в том числе подверженных ошибкам негомологичными конец присоединения, в дрожжах и клетках млекопитающих 19-22. Интеграция нашей генной ловушки вектора может привести к выражению EGFP двумя различными механизмами. Первым из них является истинным событием ген ловушка (рис. 1C): вектор интегрируется в геном (IMG для Insertionally мутантный ген), слияние транскриптов между 5 &#39;эндогенного IMG стенограммы и Gal4-VP16 производится и переведены на Слитый белок, содержащий N-конец белка, кодируемого IMG и GAL4-VP16. Это гибридный белок связывается с 14x БАС и активирует транскрипцию EGFP. Второй, менее желательно событие является усилитель ловушка (рис. 1D): минимальный промотор перед EGFP падает под контролем энхансера вблизи сайта интеграции, что приводит к производству EGFP в АВствие Gal4-VP16 производства. По нашим оценкам, 30-50% событий экспрессии EGFP обусловлены усиливающего ловушку и 50-70% обусловлены геном ловушку 23 (Balciuniene соавт. В стадии подготовки). Чтобы различать эти два класса событий, мы сделали 14xUAS: MRFP трансгенной линии (рис. 1В), для удобства отмечены объектива конкретных γCry: (. Balciuniene др. в стадии подготовки) GFP. Генной ловушки события проверяется коэкспрессией GFP и RFP (ср. С и D на рисунке 2). В нашем пилотном экран, мы восстановлены более 40 генов ловушки события после проверки 270 F0 рыбу вводят смесью транспозонов ДНК и транспозазы мРНК. Двое из наших генов ловушки интеграции произошли в гены с ранее опубликованными химически индуцированных мутантов: NSF и FLr. Фенотипы нашей инсерционные мутантов NSF tpl6 и FLr tpl24 внешне неотличимы от фенотипас соответствующих химически индуцированных мутантов. Мы также отметили, что ген ловушки события появляются нужной интронов вблизи 5 &#39;конца генов, тем самым увеличивая вероятность нулевых аллелей. Мы делаем наблюдать некоторую степень UAS глушителей (пестрота) во всех наших ген ловушки линий, и некоторые локусы явно более восприимчивы к пестроте, чем другие. Мы не верим, что БАС молчание является серьезной проблемой для распространения гена ловушки линий, как мы были в состоянии легко распространяются все наши ген ловушки линий по крайней мере пяти поколений, выбрав для выражения GFP в одиночку.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Большой размер сцепления и внешний развитие оптически прозрачных эмбрионах сделать данио исключительную позвоночных модельную систему для инсерционного мутагенеза в естественных условиях с использованием флуоресцентных журналистам помечать выражение мутировавших генов. Несколько лабораторий изготовлены и испытаны энхансерные-и ген-ловушки векторы у рыбок данио, используя флуоресцентные белки, Gal4-и Лекса основе активаторы транскрипции как репортеров 1-7. Эти векторы было два потенциальных недостатка: субоптимальный строгость (например, отсутствие способности различать энхансерных-и ген-ловушки событий) и низкой мутагенность (например, интеграции в генах редко производимых нулевые аллели). Джин Главные транспозонов (ГБЦ) были разработаны для удовлетворения этих недостатков 8-10. Мы модифицировали один из первых векторов ББТ, GBT-R15, для использования с GAL4-VP16 в качестве основного гена-репортера ловушки и добавили UAS: EGFP в качестве вторичного репортера прямого обнаружения генной ловушки событий.РИМЕНЕНИЕ из Gal4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортер предоставляет два основных преимущества. Во-первых, это повышает чувствительность генов, выраженных при низких уровней экспрессии. Во-вторых, это позволяет использовать исследователей генной ловушки линии, как Gal4 драйверов в непосредственной экспрессии трансгенов в других очень специфических тканей. Это особенно актуально для генов с несущественных или избыточных функций, где интеграция гена ловушка не может привести к явных фенотипов. Недостатком использования GAL4-VP16 в качестве основного гена ловушки репортера в том, что гены, кодирующие белки с сигнальных последовательностей N-концевых не поддаются захвата, так как в результате слитые белки GAL4-VP16, вряд ли будут способны проникать в ядро ​​и активировать транскрипция. Важно отметить, что использование Gal4-VP16 не заранее выбрать для ядерных белков: мы выздоровел генной ловушки мутации в генах, кодирующих белки, которые функционируют в ядре, цитоплазме и мембране.

В успешной инъекции, по крайней мере, 80% эмбрионов вводили в ген ловушки ДНК / Tol2 транспозазы мРНК смеси отображать определенную степень флуоресценции GFP (рис. 3). Когда самые яркие GFP-положительных эмбрионы (рис. 3C) выбраны так, чтобы установить F0 бассейн, примерно один из 10 экранированных F0 рыбы даст генной ловушки потомство. Среди F0 рыбы, из которой ген ловушки события восстанавливаются, наиболее передавать одно событие генной ловушки в дополнение к нескольким, не выражающих транспозонов интеграции. Тем не менее, мы установили до четырех генов ловушки линий от одной F0 личности. GFP / RFP паттерны экспрессии в генной ловушки линий в диапазоне от крайне тканеспецифическую (например, в обонятельных луковиц) до довольно вездесущий. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Рисунок 1. Тон Gal4 содержащих двудольный ген ловушка вектор ББТ-B1 и ее приложения. А. Компоненты Gal4 содержащего ген ловушки вектора: Tol2 5 &#39;и Tol2 3&#39;, минимальная Tol2 транспозонов заканчивается 13; CSA, Карп β-актин сращивания акцептор 8; ^ Gal4-VP16, АВГ-менее Gal4-VP16; ZP ( A), данио β-актина UTR 3 &#39;и поли (А) элементы из GBT-R15 9,10. 14XUAS, EGFP и SV40 р (А) являются компонентами БАС: EGFP выражение кассета 17,18. Стрелка указывает активацию БАС: EGFP по Gal4-VP16 производится гена ловушку В. 14XUAS:. MRFP трансген отмечен объектива конкретных γCry: GFP кассеты. Стрелка указывает активацию БАС: MRFP по Gal4-VP16 в транс ловушки случае С. гена.. Синие коробки экзоны. Сращивание обозначено пунктирной линией. Ловушка событий D. Enhancer. Интеграция вектора ближайшее усилителя (коричневый коробка) может разместить минимальный EGFP промотор под контролем этого усилителя (коричневая стрелка). Это приведет к ткане-специфической экспрессии EGFP, но так как GAL4-VP16 не производится, выражение MRFP не будет активирован. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Рисунок 2. Реверсия ген ловушки событий, используя Cre рекомбиназу. , B. Схема генной ловушки мутации (А) и Cre-ловушки возвращенной ген аллеля (B). C, D. Совместная экспрессия GFP (С) и RFP (D) в нервной системе NSF гена tpl6 ловушка линии. E, F. Инъекция Cre РНК в NSF эмбрионов tpl6 приводит к потере GFP (E) и RFP (F) выражения. Следует отметить, что не существует снижение экспрессии GFP в линзе, как и ожидалось. Рисунок 3. Эмбрионы введенные с ББТ-B1 (pDB783) гена ловушку. . А. Эмбрионы вводили pGBT-B1 (pDB783) в одиночку дисплей немного GFP флуоресценции в тело В, С. Эмбрионы вводили pGBT-B1 и Tol2 транспозазы мРНК: случайная группа эмбрионов (В) и высоких Экспрессоры выбранных для выращивания (C). <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Рисунок 4. Экспериментальная схема для создания Gal4 ген ловушки линий. Небольшая перекрывающиеся красный / зеленый структуры указывают коэкспрессией GFP и RFP, в то время как зеленый покое указывает мозаицизма для генной ловушки или усилитель ловушки событий.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Этот протокол описывает метод генной ловушки инсерционного мутагенеза с использованием Gal4-VP16 в качестве основного репортера и GFP / RFP качестве вторичного журналистами в рыбок данио. Примерно один из десяти высокого выражения F0 гена выход рыбы ловушки потомство коэкспрессирующей GFP и RFP. Процедура скрининга могут быть легко масштабируется для адаптации к размеру лабораторией, проводящей инсерционного мутагенеза экран.

Джин Захват Использование Gal4 в данио рерио

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Глобальный анализ экспрессии генов Использование данио рерио Платформа Microarray олигонуклеотидов

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Высокое разрешение Всего горе<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в Эмбрионы рыбок данио изучить экспрессию генов и функции

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging взрослых данио рерио

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...