Name: gene trapping using gal4 in zebrafish
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Vi tackar Dr Jennifer Emtage för kritisk läsning av manuskriptet, Ryan Gill för tekniskt stöd och hjälp med zebrafisk omsorg och Dr Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) för reagenser. Vårt arbete har stötts av Temple University College of Science and Technology och National Institutes of Health (R01-HD061749).

1. Produktion av F0 generationen av mikroinjektion av Gene Trap. Vi har funnit att embryon av olika genetisk bakgrund visar olika toleranser för detta förfarande, med pet-butik baserad vildtyp och Tuebingen - Long Fin (TLF) är den mest toleranta medan AB och Tuebingen stammar har sämre överlevnad. <ol><li> Beredning av transposon-DNA. Förbered GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. Under utarbetande) plasmid-DNA med hjälp av standard QIAprep miniprep kit (Qiagen 27106). Det är viktigt att ta med PB tvättsteget (som är tillval i QIAprep förfarande), annars miniprep DNA förorenas av RNas A, vilket leder till nedbrytning av transposaset mRNA. Före injektion, späd DNA i RNas-fritt vatten (Ambion AM9937) till 10 ng / ul. </li><li> Beredning av transposas mRNA. Linjärisera pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 med användning av Xbal och transkribera den lineariserade DNA med en mMessage Maskin T3(Ambion AM1348) in vitro transkription kit. Vi har modifierat det in vitro transkription reaktion genom att tillsätta 0,5 l av RiboLock RNas-hämmare (Thermofermentas EO0381). Efter DNas behandlingssteget, rena mRNA med användning av ett RNeasy MinElute kit (Qiagen 74204). Bedöma kvaliteten på den in vitro-transkriberat mRNA genom agarosgelelektrofores. Späd mRNA i RNas-fritt vatten till 40 ng / | il, och lagrar som 2 | il alikvoter vid -80 ° C. </li><li> Beredning av mikroinjektion mixen. Före injektion till 8 pl av utspätt transposon-DNA till en 2 pl alikvot av transposas mRNA. </li><li> Mikroinjektion. Spruta in 3 nl av DNA / RNA-blandningen i äggulan i en cell zebrafisk embryon genom att använda standardmikroinjektionsteknik, siktar på äggulan / blastomere gränssnitt. Samla embryon var 20 min för att säkerställa injektion vid 1 cellstadiet. I vår erfarenhet, kan en skicklig person som lätt injicera 1.000 embryon i 1-1,5 tim. </li><li> Efter injektionen, springa 5 pl vänsteröver injektionslösningen på en 1% agarosgel för kvalitetskontroll, för att säkerställa att nämnda transposas-mRNA inte har brutits ned. </li><li> Injicerade embryo vård. På sena eftermiddagen, ta bort obefruktade och onormala embryon och distribuera embryon till 60-80 per 100 mm petriskål. Onormala och döda embryon tas bort på 1 dag efter befruktning (DPF), 2 dpf och 3 dpf. </li><li> Screening för GFP uttryck. Skärm embryon utan uppenbara defekter för GFP fluorescens vid 3 dpf (Figur 3). Screening kan göras antingen på ett stereomikroskop försett med fluorescens (vi använder Nikon en SMZ1500) eller på en upprättstående mikroskop (vi använder en Zeiss AxioImager med en 5X Fluar mål). Låg GFP uttryck anger antingen misslyckad injektion eller nedbrytning av transposas RNA grund av RNas föroreningar (Figur 3A). Välj ungefär 30% av de ljusaste embryona som antingen har GFP uttryck i flera vävnader eller i en hög andel av celler i en specifik vävnad (jämför Figures 3B och 3C). Ur en injektion på 1000 embryon, har vi oftast upp till 100 utvecklings-normal, hög-GFP-uttryck embryon. </li><li> Höj utvalda F0 embryon med användning av standardzebrafisk uppfödningsförfaranden. Det är rimligt att förvänta sig att 20-30% av de injicerade embryona väljs ut för uppfödning kommer att överleva till vuxen ålder. </li></ol> 2. Underhåll av UAS: mRFP Tester Line. Vi har genererat en 14xUAS: mRFP linje markerad med objektiv specifika γCry: GFP. Sedan UAS är föremål för att tysta genom DNA-metylering är det viktigt att välja fisk med låga nivåer av ljuddämpning för att propagera mälden. <ol><li> Sätt upp individuella UAS: mRFP homozygoter för parning med en av våra mest pålitliga Gal4 gen fälla linjer, NSF tpl6 (Balciuniene m.fl. i beredningen.). </li><li> Nästa dag, överföra UAS: mRFP fisk som gav embryon till enskilda statiska tankar, medan embryona samlasoch rengöras. </li><li> Skärm embryon för GFP och RFP fluorescens vid 1 dpf och 3 dpf. </li><li> Intern korsning fisk som gav embryon med hög mRFP expression för att fastställa nästa generation av UAS: mRFP linje. </li></ol> 3. Screening av F0 Fisk. <ol><li> Korsa individuell F0 med homozygot UAS: mRFP fisk (Figur 4). Vi injicera brukar våra GBTs i rader med vildtyp eller leopard pigmentemönster, och våra homozygota UAS: mRFP linjen är i mässing bakgrunden. Därför kan GBT-injicerade F0 fisk vara lätt att skilja från de UAS: mRFP fisk, vilket eliminerar behovet att spela om F0 som kontrolleras var en manlig eller en kvinnlig och potentiella fel till följd av misstag i inspelning och / eller bestämmer kön varje fisk. Personal med mycket begränsad erfarenhet, sådana oss studenter, därför kan ställa upp och bryta ner fisk parningar. Denna metod har en nackdel att två olika genetisk bakgrund äranvänds, potentiellt komplicerande tolkning av förlorad funktion fenotyper. </li><li> Nästa dag, återmässings UAS: mRFP fisk till sin tank. Placera F0 fisk som gav embryon i enskilda statiska tankar (vi använder Hagen Exo Terra Faunarium Liten, men någon liten tank kan användas för detta ändamål), medan embryon samlas och siktas. </li><li> Ren och överföra insamlade embryon till nya petriskålar (&lt;100 per fat) på eftermiddagen på dagen 0. </li><li> Skärm embryon för GFP och RFP fluorescens vid 1 dpf, 2 dpf och 3 dpf. Dra embryon positivt för både GFP och RFP ut, sortera dem efter GFP / RFP uttrycksmönster (om fler än ett mönster kan observeras i en koppling) och höja dem för att etablera F1-generationen. </li><li> Avliva F0 fisk som produceras enbart negativa embryon (av totalt antal 50-100 embryon). </li><li> Korsa F0 fisk som producerade GFP / RFP-positiv avkomma igen för att få en andra omgång positiva. </li></ol> 4.Screening av F1 Fisk. F1 fisk undersöks för att fastställa F2 familjer, för att dokumentera gen fälla uttrycksmönster och frysa partier av embryon för molekylär identifiering av genen fälla loci med 5 &#39;RACE och invers PCR. <ol><li> Korsa individuell F1 fisk med homozygot UAS: mRFP fisk (Figur 4). </li><li> Nästa dag, placera F1 fisk som gav embryon i enskilda statiska tankar medan embryona samlas och siktas. </li><li> Skärm embryon för GFP och RFP fluorescens vid 1 dpf, 2 dpf och 3 dpf. Separata och fotografera embryon positivt för både GFP och RFP 24. </li><li> Vid 5 dpf, frysa partier av 20 GFP / RFP-positiva och 20 GFP / RFP-negativa embryon för identifiering av insättnings muterade gener genom omvänd PCR och 5&#39;RACE 9,10. Höj återstående GFP / RFP-positiva embryon för att upprätta F2-generationen. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

Dessa författare har inget att lämna ut.

Den gen fälla vektorer och metod som beskrivs här används redan i flera oberoende laboratorier. Enligt vår erfarenhet finns det två viktiga steg i processen. Den första kritiska steget är att uppnå en hög frekvens av genen fälla integration i injicerade F0 embryon. Underlåtenhet i detta steg kan ofta hänföras till RNas förorening av injektions reagenser, speciellt miniprep DNA. Det är också mycket viktigt att injicera embryon vid en cellstadiet för geninfångningsexperiment. Enligt vår erfarenhet är Tol2-medierad genmodifiering mycket effektiv, vilket gör det möjligt att få fram transgena linjerna även vid injektion senast den 1 cellstadiet eller med lägre kvalitet DNA. Undermåliga injektioner är mycket mer problematisk när den utför genfälla mutagenes, eftersom endast en liten fraktion av vektor integrationer resultera i effektiva genfälla händelser. Det andra viktiga steget är att ta reda på genfälla händelser genom att korsa vår UAS: mRFP linje. Avsaknad av mRFP uttryck ärnästan alltid ett tecken på en förstärkare fälla händelse. Men ibland bristen på mRFP uttryck kan tyda tysta av de 14x UAS. Därför är det viktigt att behålla de UAS: mRFP linje i ett icke ljuddämpande tillstånd genom att sprida nästa generation med hjälp av individer med hög RFP uttryck när korsas till nsf tpl6. Vi kan förutse att göra flera förbättringar till våra genfälla vektorer och protokoll. Den första är att använda en mindre repetitiv UAS i genen fällan konstruktionen. Det har visats att en 5x UAS är tillräcklig för att uppnå full aktivering i cellkulturexperiment och att mindre repetitiva UAS-sekvenser är mindre känsliga för metylering och ljuddämpnings 6,25. Det kan också vara möjligt att utforma genfälla vektorer för helt undermutagenes, i analogi med vektorerna som används av den internationella musen genfälle konsortium och nyligen anpassade för zebrafisk 2,26,27. En annan förbättring skulle vara att använda en annan transposon system, exempelvis Sleeping Beauty 28, för att alstra en UAS: mRFP reporter linje. Detta skulle möjliggöra injektion av Tol2-baserade gen fällor direkt till reportern linjen och screening av F0s genom incrossing. Dessutom skulle detta eliminera användningen av två olika genetisk bakgrund, vilket gör tolkningen av förlorad funktion fenotyper mer okomplicerat. Även med dessa förbättringar, skulle den allmänna Gal4 genfälle protokoll presenteras här fortfarande vara fullt tillämpliga.

Insertionsmutationer har visat sig vara en kraftfull metod för att dissekera geners funktion i olika modellsystem från encelliga organismer som bakterier och jäst till flercelliga organismer som möss och växter. Varje exogena DNA (virus, transposon eller plasmid) kan fungera som en mutagen genom att avbryta väsentliga delar av gener såsom exoner eller promotorer. Den effektiva mål på sådana enkla metoder är ytterst liten i stora komplexa genom, eftersom exoner omfattar endast 1-3% av en typisk ryggradsdjur genomet. Liten effektiv måltavla storlek kan övervinnas genom mycket hög vektorintegrationskurserna, som exemplifieras av den enorma framgången för retroviral insertionsmutationer i zebrafisk 11,12. Däremot introner innefatta ca 20-30% av ryggradsdjur genom. I zebrafisk, transposon-baserade insertionsmutationer vektorer som effektivt införa noll-eller svåra hypomorphic mutationer vid integrering i introner har fått namnet &quot;gen bryta transposons &quot;(GBTs) 8-10. För effektiv integration genfälla, de använder en minimal Tol2 transposon 13,14. Mutagenicitet av GBTs förlitar sig på fisk-härledda splitsningsacceptor och transkriptionstermine / polyadenylationssekvenser. Elementen är ansvariga för GBT mutagenicitet flankeras genom direkta loxP platser för excision av Cre rekombinas. Således injektion av Cre-mRNA leder till effektiv återgång av GBT-inducerade mutationer, även om vissa transposonmutanter sekvenser kvar på integrations locus 9,10. Den nyligen publicerade GBT vektorer använder mRFP som genen fälla reporter 9,10, vilket leder till två potentiella brister. För det första är det inte känt vilken fraktion av zebrafisk gener uttrycks på en tillräckligt hög nivå för att detekteras genom direkta fluorescerande reporterfusionsproteiner. För det andra är endast en liten undergrupp av gener som förväntas ha viktiga funktioner. Det har beräknats att det bara 1,400-2,400 gener som krävs för zebrafisk development 15,16. De flesta gen fälla mutanter förväntas inte visa uppenbara fenotyper och därför kommer att ha begränsad användbarhet. För att övervinna dessa två begränsningar har vi modifierat GBT-R15 9,10 att använda med Gal4-VP16 som primär genfälla reporter (Balciuniene et al. Under utarbetande). Som med augusti lösa mRFP i GBT-R15 var translationsstartstället avlägsnades från Gal4-VP16. För direkt påvisande av genfälla händelser, våra vektorer innehåller en EGFP reporter under kontroll av 14x Gal4 UAS 17,18. Flera ytterligare funktioner är konstruerade i vår tvådelad genfällevektor. De UAS: EGFP kassetten flankeras av direkta FRT platser (grå sparrar i figur 1). Injektion av Flp-rekombinas-mRNA leder till excision av UAS: EGFP kassett, lämnar genfälle mutationen omärkt av EGFP fluorescens. Den kan sedan användas i transgena linjer som markerar specifika vävnader eller utvecklingsmässiga händelser genom GFP-fluorescens. Liksom i andraGBTs är hela genen fällan kassett flankerad av direkta loxP platser (öppna femhörningar i figur 1). Detta gör gen fälla händelser reversibel genom uttryck av Cre rekombinas, lätt upprättandet bevis på orsaksförhållande mellan en specifik integration genfälla och observerade fenotyp (Figur 2). Slutligen genfälla kassetten flankerad av inverterade I-SCEI meganuclease ställen (svarta trianglar i fig. 1). I Drosophila, är transposonmutanter integrationer ofta konverteras till borttagningar (brister) genom oprecis excision av P-elementet. Det finns inga bevis för att excision av Tol2 transposon (eller någon annan transposon aktiv i ryggradsdjur som Törnrosa, piggyBac eller Ac / Ds) kan leda till strykningar. Vi ingår därför I-SCEI platser som en potentiell surrogat metod för induktion av strykningar, även om det inte finns några bevis för att jag-SCEI kan inducera deletioner i zebrafisk. Det bör noteras att medan jag-SCEI meganukleas kan användas för att underlätta transgenes i zebrafisk, är DNA-klyvning genom I-SCEI meganuclease används för att studera DNA-reparationsmekanismer, inklusive felbenägen icke-homologa slut att gå, i jäst och däggdjursceller 19-22. Integration av vår genfällevektor kan leda till EGFP uttryck genom två olika mekanismer. Den första är en sann genfälla händelse (Figur 1C): vektorn integreras i en gen (IMG för insättnings muterade genen), en fusion avskrift mellan 5 &#39;av den endogena IMG avskriften och Gal4-VP16 görs och översätts till en fusionsprotein innehållande den N-terminalen av det protein som kodas av IMG och Gal4-VP16. Detta fusionsprotein binder till 14x UAS och aktiverar transkription av EGFP. I den andra, mindre önskvärda händelsen är en enhancer-fälla (figur 1D): den minimala promotorn framför EGFP faller under kontroll av en förstärkarsekvens i närheten av integrationsstället, vilket leder till produktion av EGFP i absinne för Gal4-VP16 produktion. I vår uppskattning, 30-50% av EGFP uttryck händelser beror på en förstärkare fälla och 50-70% beror på en gen fälla 23 (Balciuniene et al. Under utarbetande). För att skilja mellan dessa två klasser av händelser, har vi gjort en 14xUAS: mRFP transgen linje (Figur 1B), för enkelhetens skull markeras av lins specifika γCry: (. Balciuniene m.fl. i förberedelse) GFP. Gene trap händelser verifieras genom samtidig uttryck av GFP och RFP (jämför C och D i figur 2). I vår pilot skärm, återhämtade vi över 40 gen fälla händelser efter screening 270 F0 fisk injicerad med en blandning av transposon-DNA och transposas mRNA. Två av våra genfälla integrationer har inträffat i gener med tidigare publicerade kemiskt inducerade mutanter: nsf och FLR. De fenotyper av vår insättnings mutanter nsf tpl6 och flr tpl24 är ytligt omöjlig att skilja från den fenotyps av motsvarande kemiskt inducerade mutanter. Vi noterade också att genfälla händelser visas förspänd mot intron nära 5&#39;-änden av gener, vilket ökar sannolikheten för null-alleler. Vi observerar en viss grad av UAS att tysta (färgskiftning) i alla våra gen fälla linjer, och vissa loci är klart känsligare för omväxlings än andra. Vi tror inte att UAS ljuddämpning är ett betydande problem för förökning av genen fälla linjer, som vi har kunnat för att enkelt propagera alla våra gen fälla linjer genom minst fem generationer genom att välja för GFP uttryck ensam.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Stor kuvertstorlek och extern utveckling av optiskt genomskinliga embryon gör zebrafisk ett exceptionellt ryggradsdjur modellsystem för in vivo-insertionsmutationer med fluorescerande reportrar att märka uttryck av muterade gener. Flera laboratorier har konstruerat och testat förstärkare-och gen-fälla vektorer i zebrafisk, med hjälp av fluorescerande proteiner, Gal4-och lexA-baserade transkriptionsaktivatorer som reportrar 1-7. Dessa vektorer hade två potentiella nackdelar: suboptimal stringens (t.ex. brist på förmåga att skilja mellan förstärkare-och gen-fälla händelser) och låg mutagenicitet (t.ex. integreringar i gener sällan producerade null alleler). Gene Breaking Transposon (GBTs) har utvecklats för att ta itu med dessa nackdelar 8-10. Vi har ändrat en av de första GBT vektor, GBT-R15, för användning med Gal4-VP16 som den primära genen fälla reporter och lagt UAS: EGFP som sekundär reporter för direkt detektion av genen fälla händelser. ETTILLÄMPNING av Gal4-VP16 som den primära genen fällan reporter ger två stora fördelar. För det första ökar det känslighet för gener som uttrycks vid låga expressionsnivåer. För det andra, gör det möjligt för forskare att använda genfälla linjer som Gal4 drivrutiner till direkt uttryck för andra transgener i mycket specifika vävnader. Detta är särskilt viktigt för gener med icke väsentliga eller överflödiga funktioner, där genen fälla integration inte kan leda till uppenbara fenotyper. Nackdelen med att använda Gal4-VP16 som den primära genen fälla reporter är att gener som kodar för proteiner med N-terminala signalsekvenser är inte mottagliga för fångstmetoder, eftersom de resulterande Gal4-VP16 fusionsproteiner är osannolikt att kunna komma in i cellkärnan och aktivera transkription. Viktigt är att använda Gal4-VP16 inte före välja för nukleära proteiner: vi återhämtat genfälla mutationer i gener som kodar för proteiner som fungerar i kärnan, cytoplasman och plasmamembranet.

I en framgångsrik injektion, åtminstone 80% av de embryon som injicerats med den gen fälla DNA / Tol2 transposas mRNA mix visa en viss grad av GFP-fluorescens (figur 3). När den ljusaste GFP-positiva embryon (figur 3C) är valda för att fastställa F0 poolen, ungefär en av 10 skärmad F0 fisk kommer att ge genfälla avkomma. Bland F0 fisk från vilken gen fälla händelser återvinns, de flesta sänder en enda gen fälla händelse förutom flera icke-uttryck transposonmutanter integrationer. Vi har dock etablerat upp till fyra genfälla linjer från en enda F0 individ. GFP / RFP uttrycksmönster i genfälla linjerna varierar från extremt vävnadsspecifika (t.ex. i luktsinnet glödlampor) till tämligen allmänt förekommande. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figur 1. Than Gal4 innehållande tvådelad genfällevektor GBT-B1 och dess tillämpningar. A. De Gal4-innehållande genfällevektor: Tol2 5 &quot;och Tol2 3&quot;, avslutar minimal Tol2 transposon 13, CSA, Carp β-aktin splitsningsacceptor 8; ^ Gal4-VP16, augusti-mindre Gal4-VP16, zp ( A), zebrafisk β-aktin 3 &#39;UTR och poly (A) element från GBT-R15 9,10. 14XUAS, EGFP och SV40-p (A) är komponenter i UAS: EGFP expressionskassett 17,18. Pilen indikerar aktivering av UAS: EGFP av Gal4-VP16 produceras av genen fällan B. 14XUAS:. MRFP transgen markerad med en lins specifik γCry: GFP kassett. Pilen indikerar aktivering av UAS: mRFP av Gal4-VP16 i trans C. Gene fälla händelse.. Blå rutor är exoner. Skarvning indikeras med streckad linje. D. Enhancer fälla händelse. Integrering av vektorn nära en förstärkare (brun låda) kan placera den minimala EGFP promotorn under kontroll av denna förstärkare (brun pil). Detta skulle resultera i ett vävnadsspecifikt uttryck av EGFP, men eftersom Gal4-VP16 inte görs, skulle mRFP uttryck inte aktiveras. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figur 2. Återgång av genen fälla händelser med hjälp av Cre rekombinas. A, B. Diagram över en geninfång mutation (A) och Cre-återgick genfälla allel (B). C, D. Co-uttryck av GFP (C) och RFP (D) i nervsystemet hos nsf tpl6 genen fälla linje. E, F. Injektion av Cre-RNA till nsf tpl6 embryon leder till förlust av GFP (E) och RFP (F) expression. Observera att det inte finns någon minskning av GFP-uttryck i linsen, som förväntat. Figur 3. Embryon som injicerats med GBT-B1 (pDB783) genfälla. . A. Embryon injicerades med pGBT-B1 (pDB783) ensamt display little GFP fluorescens i kroppen B, C. Embryon injicerades med pGBT-B1 och Tol2 transposas mRNA: en slumpmässig grupp av embryon (B) och high-expressorer utvalda för uppfödning (C). <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figur 4. Experimentell utkast för etablering av Gal4 genfälla linjer. Delvis överlappande röd / gröna strukturer indikerar samtidigt uttryck av GFP och RFP, medan grön ensam indikerar mosaicism för gen stänga in eller förstärkare fälla händelser.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Detta protokoll beskriver metoden för genfälle insertionsmutationer använder Gal4-VP16 som den primära reporter och GFP / RFP som sekundära reportrar i zebrafisk. Ungefär en av tio högt uttrycker F0 fisk avkastnings genfälla avkomma co-uttrycker GFP och RFP. Screeningen kan lätt skalas för att anpassa sig till storleken på det laboratorium som utför insertionsmutationer skärmen.

Gene Svällning Använda Gal4 i Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Mikroinjektion av Zebrafish embryon till Analysera genfunktion

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Global Gene Expression analys med en Zebrafish plattform Oligonucleotide microarray

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hög upplösning Hela Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inom Zebrafish embryon för att studera genuttryck och funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging vuxna zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...