Name: flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays at JoVE.com

Ringraziamo Melissa Klocke per l&#39;assistenza preparare la figura 1 e Anna Ratliff per dimostrare il protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal Research Corporation per il Progresso della Scienza.

1. Microtubuli Gliding scorta di saggio Solutions Preparare in anticipo dosaggio volo a vela. <ol><li> Polimerizzare microtubuli 0,5 mg scarsamente etichettati con brillante organico fluoroforo 22. La concentrazione etichetta di destinazione è 1 fluoroforo per micrometro di microtubuli, etichettatura o una densità di circa 1 fluoroforo per 1.500 dimeri di tubulina. Conservare a temperatura ambiente, la luce protetta con alluminio, pellicola per un massimo di due settimane. </l...

<ol>
	<li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+microtubules.">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length.">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li><li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model.">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102 (2008).</li><li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length.">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li><li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking.">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li><li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness.">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li><li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers.">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li><li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity.">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li><li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements.">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li><li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Gliding+assays"+for+motor+proteins:+A+theoretical+analysis.">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li><li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics.">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627 (2011).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea.">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li><li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential.">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li><li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+tensegrity+in+cell+mechanics.">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li><li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness.">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li><li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps.">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li><li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations.">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li><li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories.">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li><li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical biology of the cell. , (2008).</li><li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments.">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li><li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific,+high-precision+label+of+microtubules.">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li><li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+modified+tubulins.">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curve+reconstruction+from+unorganized+points.">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li><li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence.">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li><li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty.">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li><li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport.">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li></ol>

Misure di lunghezza persistenza sono una buona caratterizzazione delle proprietà meccaniche dei biopolimeri singoli. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli. Come detto nell&#39;introduzione, questo metodo è facilmente esteso ad esaminare le proprietà meccaniche microtubuli in una varietà di condizioni semplicemente variando i reagenti, temperatura o viscosità nella fase finale del saggio planata, 3,9, o da microtubuli polimerizzanti, passo 1,1, in co...

Il citoscheletro, una rete di biopolimeri presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche, svolge un ruolo nella organizzazione cellulare, trasporto intracellulare, e meccanica delle cellule. Le caratteristiche meccaniche dei biopolimeri del citoscheletro (principalmente actina e microtubuli) svolgono un ruolo significativo nel determinare le caratteristiche meccaniche della cellula nel suo complesso 12. Poiché meccanica cellule intere possono caratterizzare cellule sane e malate 13,14 ed è coinvolto nella motilità cellulare 15, le proprietà meccaniche dei componenti citoscheletrici sottostanti sono un&#39;area attiva di studio per gli ultimi due decenni 1. La flessibilità (o rigidità) di biopolimeri è caratterizzato dalla lunghezza di persistenza, la lunghezza del polimero che si piega per circa un radianti sotto fluttuazioni termiche a temperatura ambiente. Un certo numero di tecniche sono state sviluppate per misurare la lunghezza di persistenza 16, per exampLe tecniche attive che coinvolgono piegare il polimero attraverso il flusso idrodinamico, trappole ottiche, o campi elettrici 4,17,18, e tecniche passive che misurano le fluttuazioni di polimeri libere in soluzione 5,6. Le misurazioni attivi, tuttavia, richiedono configurazioni specializzate per implementare forze note sulla scala del micrometro, e le misurazioni di fluttuazione libera può essere difficile a causa della diffusione di piano focale del microscopio utilizzato. In questo articolo, si descrive un complementare, passiva, tecnica per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli, un polimero del citoscheletro. La tecnica prevede saggi volo a vela, che assicurano che il polimero rimane sempre nel piano focale 19. Inoltre, esso comporta il rilevamento fluorofori singoli collegati in modo permanente al polimero di interesse, in modo che punti specifici lungo il polimero sono ben caratterizzati. Un cartone animato del metodo è illustrato nella Figure 1. Kinesina si muove in particolare verso la fine + di microtubuli, in modo che i microtubuli in un test di volo a vela sono spinti unidirezionale. L&#39;estremità anteriore del microtubulo, oltre l&#39;ultima chinesina collegato, è libero di fluttuare sotto le forze termici della soluzione circostante. Come il microtubulo viene spinto in avanti, fino alla fine oscilla legarsi a una molecola chinesina nuovo più avanti lungo il vetrino si congela in una fluttuazione dato. Poiché chinesina attribuisce microtubuli fortemente, la microtubuli è costretto a seguire il percorso della estremità anteriore. Pertanto, le fluttuazioni statistiche congelati nella traiettoria microtubuli sono le stesse delle fluttuazioni statistiche della estremità libera 11 microtubuli, e può quindi essere utilizzata per calcolare la lunghezza di persistenza secondo 20 <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; dove L è la lunghezza p persistenza del microtubulo, s θ è l&#39;angolo tra tangenti alla traiettoria separate da una lunghezza s contorno, e &lt;&gt; indica una media di tutte le coppie di posizioni separate da una lunghezza s contorno. Il saggio di scorrimento si utilizza chinesina biotinilato al coiled-coil 21 legato specificamente al vetrino tramite una streptavidina-biotina linkage. Questo accessorio assicura che i domini motore sono liberi di legarsi ai microtubuli e spingere. Al fine di seguire traiettorie microtubuli, microtubuli sono scarsamente etichettati con fluorofori organici 22,23 - le etichette devono essere sparso abbastanza fluorofori singoli sono risolvibili utilizzando singola molecola microscopia a fluorescenza. Fluorofori singole sono monitorati tramite routine di analisi di immagini scritte in IDL. Le traiettorie di ciascun fluoroforo legato ad un determinato microfonorotubule sono combinati in una traiettoria microtubulo automaticamente composito 24. Gli angoli θ tangente ad ogni punto lungo una traiettoria vengono calcolati; da questi angoli tangenti l&#39;&lt;cosθ s&gt; valore viene calcolato per ogni s lunghezza dei contorni. Infine, questi dati sono idonei a Eq. 1 in modo da estrarre una lunghezza di persistenza per un determinato microtubulo, o per molti microtubuli nello stesso dosaggio scorrimento. Il metodo è abbastanza robusta per lavorare con microtubuli preparati in una varietà di condizioni (con differenti agenti stabilizzanti o altre piccole molecole legate al microtubulo, con proteine ​​legate associati microtubuli (MAP), o con una varietà di soluzioni viscose). Nel nostro laboratorio, la tecnica è stata utilizzata per caratterizzare la lunghezza di persistenza dei microtubuli in funzione della lunghezza lungo i microtubuli ei microtubuli con diversi agenti stabilizzanti. La limitazione principale è che i microtubuli devono ancora sOSTEGNO chinesina motilità. Poiché chinesina è un enzima motore robusto, questa è una restrizione abbastanza sciolto. Sostituendo con actina e microtubuli chinesina con un enzima famiglia miosina, la lunghezza di persistenza di actina può essere misurata utilizzando la stessa tecnica.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reagenti</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro di potassio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro di magnesio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinilato BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseina</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidina</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiotreitolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratori</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosio ossidasi</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalasi</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoetanolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Acquista piccola quantità.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm N ° 1 1/2 bicchiere di copertura</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 mm N ° 1 bicchiere di copertura</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasso per alto vuoto</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Attrezzatura</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF microscopio</td&gt;<td&gt; Molti</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Il microscopio TIRF utilizzato in questo metodo è stato fatto in casa.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Potrebbe sostituire MATLAB, ImageJ, o altri software di analisi dell&#39;immagine.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

I microtubuli sono polimeri del citoscheletro che svolgono un ruolo nella divisione cellulare, cellulari, meccanica e mezzi di trasporto intracellulare. Ciascuna di queste funzioni richiede microtubuli che sono rigidi e dritti abbastanza per occupare una frazione significativa del diametro della cellula. Come risultato, la lunghezza di persistenza microtubuli, una misura della rigidità, è attivamente studiati negli ultimi due decenni 1. Tuttavia, restano questioni aperte: microtubuli brevi sono 10-50 volte meno rigido rispetto microtubuli lunghi 2-4, e anche lungo i microtubuli hanno misurato lunghezze persistenza che variano da un ordine di grandezza 5-9. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare la persistenza lunghezza microtubuli. Il metodo si basa su un saggio microtubuli chinesina-driven scorrimento 10. Grazie alla combinazione di scarsa marcatura fluorescente dei microtubuli singoli con servizio di monitoraggio singola particella di fluorofori singoli collegati al microtubulo, il Glidintraiettorie g di microtubuli singoli vengono tracciati con precisione a livello di nanometri. La lunghezza di persistenza delle traiettorie è uguale alla lunghezza di persistenza del microtubulo nelle condizioni utilizzate 11. Una routine di rilevamento automatico viene utilizzato per creare traiettorie microtubuli da fluorofori collegati microtubuli singoli, e la lunghezza di persistenza di tale traiettoria è calcolata utilizzando routine scritte in IDL. Questa tecnica è attuabile rapidamente, e in grado di misurare la lunghezza di persistenza di 100 microtubuli in un giorno di sperimentazione. Il metodo può essere esteso per misurare la lunghezza di persistenza sotto una varietà di condizioni, tra lunghezza di persistenza in funzione della lunghezza lungo i microtubuli. Inoltre, le routine di analisi utilizzate può essere esteso a miosina basati azione saggi scorrimento, per misurare la lunghezza di persistenza dei filamenti di actina pure.

Un&#39;istantanea da un saggio scorrimento è mostrato in Figura 2. Una buona densità microtubuli è microtubuli 1-10 per campo; sostanzialmente più provocherà sbandamento come microtubuli incrociano. Un grafico delle traiettorie 11 microtubuli del dosaggio scorrimento in figura 2 è mostrato in Figura 3. Traiettorie tipiche sono 10-30 micron di lunghezza, alcune traiettorie presentano spazi vuoti dove si incrocia un altro microtubuli. Tali traiettorie possono essere...

Watch this Scientific Journal Video about Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays at JoVE.com

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Ricerca

Bioingegneria

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-Particle Image Velocimetry per Velocity Misure profilo dei flussi Micro sangue

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Molecolare Entanglement e Electrospinnability di biopolimeri

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Misure di potenza ingresso in bioreattori agitate a scala di laboratorio

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Un sistema di prova millimetro scala flessionale per misurare le proprietà meccaniche di spicole di spugna marina

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...