Name: flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00
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Damos las gracias a Melissa Klocke de asistencia preparando la Figura 1 y Ratliff Anna para demostrar el protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Corporación de Investigaciones para el Avance de la Ciencia.

1. Microtúbulos delta del ensayo de Soluciones Prepárese con ensayo de deslizamiento. <ol><li> Polimerizar 0,5 mg microtúbulos poco marcados con fluoróforo brillante orgánica 22. La concentración etiqueta de destino es 1 fluoróforo por micrómetro de microtúbulos, o una densidad de etiquetado de aproximadamente 1 por cada 1.500 fluoróforo dímeros de tubulina. Almacenar a temperatura ambiente, protegida de la luz con aluminio, papel de aluminio de hasta dos semanas. </l...

<ol>
	<li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+microtubules.">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length.">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li><li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. 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Mediciones Longitud persistencia son una buena caracterización de las propiedades mecánicas de biopolímeros individuales. En este artículo, hemos descrito un método de medición de la longitud de persistencia de los microtúbulos. Como se ha señalado en la introducción, este método se extiende fácilmente a examinar las propiedades mecánicas de microtúbulos en una variedad de condiciones, simplemente variando los reactivos, la temperatura o viscosidad en la etapa final del ensayo de deslizamiento, 3,9, o por p...

El citoesqueleto, una red de biopolímeros se encuentran en la mayoría de las células eucariotas, desempeña un papel en la organización celular, el transporte intracelular, y la mecánica celular. Las características mecánicas de los biopolímeros del citoesqueleto (principalmente actina y microtúbulos) desempeñan un papel importante en la determinación de las características mecánicas de la célula como un todo 12. Puesto que la mecánica de células enteras puede caracterizar células sanas y enfermas 13,14 y está implicado en la motilidad celular 15, las propiedades mecánicas de los componentes del citoesqueleto subyacentes han sido un área activa de estudio para las dos últimas décadas 1. La flexibilidad (o rigidez) de los biopolímeros se caracteriza por la persistencia de longitud, la longitud de polímero que se dobla por aproximadamente un radián menores fluctuaciones térmicas a temperatura ambiente. Una serie de técnicas han sido desarrolladas para medir la longitud de persistencia 16, para example activos técnicas que implican doblar el polímero utilizando flujo hidrodinámico, trampas ópticas, o campos eléctricos 4,17,18, y técnicas pasivas que miden las fluctuaciones de polímeros libres en solución 5,6. Las mediciones activos, sin embargo, requieren configuraciones especiales para aplicar fuerzas conocidas en la escala del micrómetro, y las mediciones de libre fluctuación puede ser difícil debido a la difusión fuera del plano de foco del microscopio utilizado. En este artículo, se describe un complementaria, técnica pasiva, para medir la longitud de persistencia de los microtúbulos, un polímero citoesquelético. La técnica consiste en ensayos de deslizamiento, que aseguran que el polímero permanece siempre en el plano focal 19. Por otra parte, implica el seguimiento fluoróforos individuales unidos permanentemente al polímero de interés, de modo que los lugares específicos a lo largo del polímero están bien caracterizados. Una caricatura del método se muestra en la Figure 1. Kinesin mueve específicamente hacia el extremo + de microtúbulos, por lo que los microtúbulos en un ensayo de deslizamiento son impulsados ​​unidireccionalmente. El extremo delantero de los microtúbulos, más allá de la quinesina último unido, es libre de fluctuar bajo las fuerzas térmicas de la solución circundante. Como los microtúbulos es propulsado hacia adelante, el extremo fluctúa hasta la unión a una molécula de quinesina nuevo aún más a lo largo de la lámina de vidrio se congela en una fluctuación dada. Debido a kinesin concede microtúbulos muy fuertemente, los microtúbulos se ve obligado a seguir el camino del extremo delantero. Por lo tanto, las fluctuaciones estadísticas congelados en la trayectoria de microtúbulos son las mismas que las fluctuaciones estadísticas del extremo libre 11 de los microtúbulos, y por lo tanto se puede utilizar para calcular la longitud de persistencia de acuerdo con 20 <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; donde p es l la longitud de persistencia de los microtúbulos, s θ es el ángulo entre las tangentes a la trayectoria separados por una longitud de contorno s, y &lt;&gt; denota un promedio sobre todos los pares de posiciones separadas por una longitud de contorno s. El ensayo de deslizamiento misma utiliza kinesin biotinilado en el enrollado de la bobina 21 se unía específicamente a la placa de vidrio mediante un enlace estreptavidina-biotina. Esta unión se asegura de que los dominios de motor son libres para unirse a microtúbulos y propulsar. Con el fin de seguir la trayectoria de microtúbulos, los microtúbulos están escasamente etiquetados con fluoróforos orgánicos 22,23 - las etiquetas deberán ser lo suficientemente escasa que fluoróforos individuales se pueden resolver utilizando microscopía de fluorescencia de una sola molécula. Fluoróforos individuales son rastreados utilizando rutinas de análisis de imágenes escrito en IDL. Las trayectorias de cada fluoróforo unido a un micrófono dadorotubule se combinan en una trayectoria de microtúbulos compuesto automáticamente 24. Los ángulos tangentes θ para cada punto a lo largo de una trayectoria se calculan, a partir de estos ángulos tangentes de la &lt;cosθ s&gt; valor se calcula para cada longitud de contorno s. Finalmente, estos datos se ajustan a la ecuación. 1 con el fin de extraer una longitud de persistencia para un microtúbulo dado, o para muchos microtúbulos en el mismo ensayo de deslizamiento. El método es lo suficientemente robusto como para trabajar con los microtúbulos preparados en una amplia variedad de condiciones (con diferentes agentes estabilizantes u otras moléculas pequeñas unidas a los microtúbulos, con las proteínas microtubulares unidos asociadas (MAPs), o con una variedad de soluciones viscosas). En nuestro laboratorio, la técnica se ha utilizado para caracterizar la longitud de persistencia de los microtúbulos como una función de la longitud a lo largo de los microtúbulos y los microtúbulos con diferentes agentes estabilizantes. La restricción principal es que los microtúbulos todavía debe spoyo kinesin motilidad. Desde quinesina es una enzima motor robusto, esta es una restricción bastante suelta. Mediante la sustitución de microtúbulos con la actina y la quinesina con una enzima de familia de la miosina, la longitud de persistencia de la actina puede ser medida utilizando la misma técnica.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reactivos</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro potásico</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro de magnesio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinilado BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseína</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estreptavidina</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiotreitol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratorios</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosa oxidasa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalasa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoetanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Comprar pequeña cantidad.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm N º 1 1/2 tapa de vidrio</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm N º 1 cubierta de vidrio</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasa de alto vacío</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Equipos</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscopio TIRF</td&gt;<td&gt; Muchos</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; El microscopio TIRF utilizado en este método fue hecho en casa.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; ¿Podría sustituir MATLAB, ImageJ, u otro software de análisis de imágenes.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto que desempeñan un papel en la división celular, la mecánica celular y el transporte intracelular. Cada una de estas funciones requiere microtúbulos que son rígidos y recta suficiente para abarcar una fracción significativa de la célula de diámetro. Como resultado, la longitud de persistencia microtúbulos, una medida de la rigidez, se ha estudiado activamente durante las últimas dos décadas 1. No obstante, las preguntas abiertas permanecen: microtúbulos cortos son 10-50 veces menos rígidos que los microtúbulos largos 2-4, e incluso microtúbulos largas han medido las longitudes de persistencia que pueden variar en un orden de magnitud 5-9. A continuación, se presenta un método para medir la longitud de microtúbulos persistencia. El método se basa en un kinesin impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento 10. Mediante la combinación de etiquetado fluorescente escaso de microtúbulos individuales con seguimiento sola partícula de fluoróforos individuales unidos a los microtúbulos, la gliding trayectorias individuales de los microtúbulos se realiza un seguimiento con precisión nanométrica nivel. La persistencia de longitud de las trayectorias es la misma que la longitud de persistencia de los microtúbulos en las condiciones utilizadas 11. Una rutina de seguimiento automatizado se utiliza para crear trayectorias de microtúbulos a partir de los fluoróforos unidos a los microtúbulos individuales, y la longitud de persistencia de esta trayectoria se calcula utilizando las rutinas escritas en IDL. Esta técnica es rápida implementación, y capaz de medir la longitud de persistencia de 100 microtúbulos en un día de experimentación. El método puede ser extendido para medir la longitud de persistencia bajo una variedad de condiciones, incluyendo la longitud de persistencia como una función de la longitud a lo largo de microtúbulos. Además, las rutinas de análisis usados ​​pueden extenderse a miosina de acción basados ​​en ensayos de deslizamiento, para medir la longitud de persistencia de los filamentos de actina también.

Una instantánea de un ensayo de deslizamiento se muestra en la Figura 2. Una densidad de los microtúbulos es bueno microtúbulos 1-10 por campo de visión; sustancialmente más resultará en mal seguimiento como microtúbulos se cruzan entre sí. Una gráfica de las trayectorias 11 de microtúbulos a partir del ensayo de deslizamiento en la Figura 2 se muestra en la Figura 3. Trayectorias típicas son de 10 a 30 um de largo; algunas trayectorias tienen espacios donde ...

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Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

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