Name: electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo
Uploaded: 2013-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Nous remercions le Dr Yuval Dror Gottlieb-pour l&#39;illustration d&#39;électroporation. Ce travail a été soutenu par des subventions à DSD de l&#39;Institut national pour la psychobiologie en Israël et dans le programme de coopération Niedersachsen-Israël pour la recherche et par des subventions à AK de la Fondation Israël Science, le ministère israélien de la Santé et le Centre du Patrimoine Excellence-Legacy partenariat des sciences biomédicales.</p&gt;

1. électroporation Rhombencéphale 1.1 manipulation des oeufs <ol><li> Placez les oeufs horizontalement dans un incubateur humidifié (37 à 38,5 ° C). Les embryons sont électroporation après 65-70 heures d&#39;incubation, quand ils atteignent 16-17 (HH) stade (25-30 somites). </li><li> Retirer les oeufs de l&#39;incubateur, ils restent en position horizontale. </li></ol> 1.2 Préparatifs <ol><li> Tirez capillaires en verre (0,5 mm de diamètre). </li><li> Connexi...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat:+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive.">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li><li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive,+interoceptive,+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1.">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li><li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei.">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain.">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor.">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).</li><li>Muller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+factor+Olig3+coordinates+the+specification+of+dorsal+neurons+in+the+spinal+cord.">The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord.</a> Genes Dev. 19, 733-743 (2005).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+and+dorsal+root+ganglion+axons+serve+as+choice+points+for+the+ipsilateral+turning+of+dI3+axons.">Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons.</a> J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4, 21 (2009).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Patterns+and+Targets+of+dA1+Interneurons+in+the+Chick+Hindbrain.">Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain.</a> J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+delineation+of+ischemic+tissue+in+rat+brain+cryosections+by+high-contrast+staining.">Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining.</a> Stroke. 30, 1134-1141 (1999).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-like+elements+in+the+pink+bollworm,+Pectinophora+gossypiella.">piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella.</a> Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).</li><li>Leal-Ortiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piccolo+modulation+of+Synapsin1a+dynamics+regulates+synaptic+vesicle+exocytosis.">Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis.</a> J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li><li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation.">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li><li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms.">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).</li><li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain:+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition.">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li><li>Clarke, J. D., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+repetition+of+neuronal+phenotype+sets+in+the+chick+embryo+hindbrain.">Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain.</a> Development. 118, 151-162 (1993).</li><li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo.">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li><li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail/chick+chimeras:+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei.">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

En électroporation in ovo est un outil réalisable, fiable et efficace pour examiner la spécification des cellules et le guidage axonal au cours de poussin développement du système nerveux 20. Dans ce protocole, nous décrivons un mode d&#39;électroporation dans le cerveau postérieur de poulet à E2.75 utilisant des éléments amplificateurs qui permettent l&#39;étiquetage conditionnelle des interneurones spécifiques. Cette stratégie est combiné avec le système de transposition Pi...

Le cerveau postérieur représente une plaque tournante du relais clé du système nerveux par la communication entre les systèmes nerveux central et périphérique via ascendant et descendant des réseaux neuronaux. Il régule les fonctions de base, y compris la respiration, la conscience, l&#39;audition et la coordination motrice 1-3. Au cours du développement embryonnaire, le cerveau postérieur vertébré est subdivisé de manière transitoire le long de son axe antéro-postérieur (AP) dans rhombomères répétitifs, dans lequel les types de cellules neuronales distinctes sont formées et générer de multiples centres des noyaux du tronc cérébral 4. Le cerveau postérieur est également divisé le long de son axe dorso-ventral (DV) dans une plaque basale et Alar, au cours de laquelle progéniteurs neuronaux distincts deviennent spécifiés et se différencient dans des endroits distincts DV 3,5,6. Comment le début AP et spécifiques DV modèles neuronaux sont relatives à la création de circuits de tronc cérébral fonctionnel est largement inconnue. D&#39;acquérir des connaissances sur ce principe fondamentalquestion, des outils sont nécessaires pour étiqueter sous-ensembles spécifiques de neurones dans le cerveau postérieur au début et à retracer leurs trajectoires axonales et la connectivité à des stades plus avancés. Nous avons déjà utilisé des éléments activateurs spécifiques, et un système d&#39;expression conditionnelle Cre / loxP-base pour le suivi de trajectoire des axones des interneurones spinaux dorsaux au début embryon de poulet 7-9. Dans le manuscrit actuel, nous avons ciblé le cerveau postérieur et amélioré le paradigme expérimental pour l&#39;étiquetage fin des interneurones du cerveau postérieur embryonnaire, les axones et leurs cibles synaptiques, en utilisant une stratégie d&#39;électroporation modifié et le PiggyBac - transposition de l&#39;ADN induite. Notre nouvelle stratégie permet le marquage des sous-types neuronaux distincts dans un côté du cerveau postérieur et le suivi de leurs projections axonales et les sites synaptiques à différents stades embryonnaires, à partir de 2 jusqu&#39;à 12 jours après l&#39;électroporation. Sur la base de cette méthode, nous avons appelé la dorsale la plus sous-groupe des interneurones du cerveau postérieur (dA1/Atoh1 + </s&gt; Suivi des cellules) et révélé deux modèles de projections axonales ascendantes controlatéral, chacun vient d&#39;un endroit et s&#39;allonge AP différent dans un funiculus distinct. dA1 axones ont été trouvés à projet et le formulaire synapses dans les noyaux auditifs, le mésencéphale et dans de multiples couches du cervelet 10. La combinaison de poussin électroporation, génétique traçage des neurones et analyse des sites de projection à bien des stades avancés de développement fournit une plate-forme unique d&#39;étudier la formation des réseaux neuronaux dans le cerveau et à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la formation des circuits.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0162 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pulse generator, ECM 830</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0002</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound</td>
			<td>Tissue-Tek
				Sakura</td>
			<td>4583 O.C.T. Compound </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>From Any Commercial Supplier </td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo

Électroporation du tube neural embryonnaire poussin présente de nombreux avantages comme étant rapide et efficace pour l&#39;expression de gènes étrangers dans des cellules neuronales. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode qui démontre unique façon d&#39;électroporation d&#39;ADN dans le cerveau postérieur aviaire à E2.75 pour étiqueter spécifiquement un sous-ensemble de progéniteurs neuronaux, et comment suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à bien des stades avancés de développement, jusqu&#39;à E14.5. Nous avons utilisé des outils génétiques nouveaux, y compris des éléments spécifiques enhancer, la CRE / Lox - Plasmides et que le système de transposition ADN PiggyBac médiation pour conduire l&#39;expression de la GFP dans un sous-type de cellules du cerveau postérieur (la dorsale plus sous-groupe des interneurones, DA1). Trajectoires et les objectifs de dA1 axones axones sont suivis à des stades embryonnaires précoces et tardives à différentes régions du tronc cérébral. Cette stratégie contribue techniques avancées pour cibler des cellules d&#39;intérêt dans le cerveau postérieur embryonnaire et pour tracement formation de circuit à plusieurs stades de développement.

Ce protocole a été récemment utilisée pour découvrir les modèles axonales et les sites de projection de dA1 sous-groupe des interneurones dans le cerveau postérieur poussin 10. Pour étiqueter spécifiquement ces axones, un élément activateur (Atoh1), qui a déjà été qualifiée de spécifique pour la colonne vertébrale EL1 neurones 8,12,13, a été confirmée à exprimer en dA1 cellules cerveau postérieur 10. L&#39;élément a été cloné en amont de la recombinase Cre et ...

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Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d&#39;électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Recherche

Neurosciences

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Production d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet pour la culture des neurones murins Cellules souches Crest

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Utilisation de Zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et Adult

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...