Name: electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo
Uploaded: 2013-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Мы благодарим доктора Юваль Gottlieb-Дрор для электропорации иллюстрации. Эта работа была поддержана грантами для DSD из Национального института Psychobiology в Израиле и из Нижней Саксонии-израильской программы научно-исследовательское сотрудничество и гранты для AK от Израиля научный фонд, Министерство здравоохранения Израиля и Центр повышения квалификации-Наследие Наследие Биомедицинские партнерства науки.</p&gt;

1. Hindbrain Электропорацию 1.1 обработки яйца <ol><li> Место яйца горизонтально в увлажненном инкубаторе (37-38.5 ° C). Эмбрионы электропорации после 65-70 ч инкубации, когда они достигают 16-17 (HH) этапе (25-30 сомитами). </li><li> Удалите яйца из инкубатора, они остаются в горизонтальном положени...

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat:+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive.">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li><li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive,+interoceptive,+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1.">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li><li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei.">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain.">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor.">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).</li><li>Muller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+factor+Olig3+coordinates+the+specification+of+dorsal+neurons+in+the+spinal+cord.">The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord.</a> Genes Dev. 19, 733-743 (2005).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+and+dorsal+root+ganglion+axons+serve+as+choice+points+for+the+ipsilateral+turning+of+dI3+axons.">Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons.</a> J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4, 21 (2009).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Patterns+and+Targets+of+dA1+Interneurons+in+the+Chick+Hindbrain.">Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain.</a> J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+delineation+of+ischemic+tissue+in+rat+brain+cryosections+by+high-contrast+staining.">Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining.</a> Stroke. 30, 1134-1141 (1999).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-like+elements+in+the+pink+bollworm,+Pectinophora+gossypiella.">piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella.</a> Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).</li><li>Leal-Ortiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piccolo+modulation+of+Synapsin1a+dynamics+regulates+synaptic+vesicle+exocytosis.">Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis.</a> J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li><li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation.">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li><li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms.">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).</li><li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain:+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition.">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li><li>Clarke, J. D., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+repetition+of+neuronal+phenotype+sets+in+the+chick+embryo+hindbrain.">Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain.</a> Development. 118, 151-162 (1993).</li><li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo.">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li><li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail/chick+chimeras:+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei.">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

В ово электропорации является выполнимой, надежный и эффективный инструмент для изучения спецификации клеток и аксонов во куриных развития нервной системы 20. В этом протоколе мы опишем способ электропорации у кур на заднем мозге E2.75 использованием усилителя элементы, котор...

Задний мозг представляет одного из ключевых узлов реле нервной системы, общаясь между центральной и периферической нервной системы с помощью восходящих и нисходящих нейронных сетей. Он регулирует основные функции, включая дыхание, сознание, слуха, координации движений и 1-3. Во время раннего эмбрионального развития, заднего мозга позвоночных временно разделена по его передне-задней (AP) оси в повторяющихся ромбомеры, в которых различные типы клеток нейронов формируются и создания нескольких центров ядер ствола мозга 4. Задний мозг также разделен вдоль его спинной-вентральной (DV) оси в базальной и крыльев пластины, на которой дискретных нейронных предшественников стать указан и дифференцироваться в различных местах DV 3,5,6. Как раннее AP и DV-конкретные нейронные паттерны, регулирующие создание функциональной схемами мозга в значительной степени неизвестно. Чтобы получить знания по этой фундаментальнойВопрос, инструменты необходимы для того, чтобы обозначить конкретные группы нейронов в мозге и ранней проследить их аксональное траекторий и связи на более поздних стадиях. Ранее мы уже использовали конкретных элементов усилителя, и Cre / LoxP основе системы условного выражения для отслеживания траектории аксональное задних спинальных интернейронов в начале куриного эмбриона 7-9. В текущем рукописи мы нацелены на заднем мозге и модернизированные экспериментальной парадигмы для маркировки поздних эмбриональных интернейронов заднего мозга, аксоны и их синаптических целей, с использованием модифицированной стратегии электропорации и PiggyBac - опосредованного переноса ДНК. Наши новые стратегии позволяет пометки различных подтипов нейронов в одну сторону заднего мозга и отслеживание их аксонального проекции и синаптической сайтов на различных стадиях эмбриогенеза, от 2 до 12 дней после электропорации. На основе этого метода, мы обозначили наиболее спинно-подгруппе интернейронов заднего мозга (dA1/Atoh1 + </sдо&gt; клетки) и выявили две противоположной восходящей аксональное проекции моделей, каждая вытекает из другого места АП и удлиняется в отдельном канатика. dA1 аксоны были обнаружены проекта и форма синапсов в слуховых ядер среднего мозга и в несколько слоев мозжечка 10. Сочетание электропорации цыпленок, генетические отслеживания нейронов и анализ проекции места на гораздо поздних стадиях развития предоставляет уникальную платформу для изучения формирования нейронных сетей в мозге и выяснить молекулярные механизмы, которые управляют схемой формирования.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0162 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pulse generator, ECM 830</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0002</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound</td>
			<td>Tissue-Tek
				Sakura</td>
			<td>4583 O.C.T. Compound </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>From Any Commercial Supplier </td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo

Электропорации цыпленок эмбриональной нервной трубки имеет много преимуществ, таких как быстрое и эффективное для экспрессии чужеродных генов в нервных клетках. В этой рукописи мы предлагаем способ, который демонстрирует, как однозначно электропорации ДНК в мозге на птичьем E2.75 для того, чтобы специально маркировать подмножество нейронных предшественников, и как следовать их аксональное прогнозы и синаптической цели на много продвинутых стадиях разработки, до E14.5. Мы использовали новые генетические инструменты, включая конкретные элементы усилителя, Cre / Жидкий кислород - на основе плазмид и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в целях обеспечения GFP выражение в подтип заднего мозга клеток (спинной наиболее подгруппе интернейронов, dA1). Траектории аксонов и задач dA1 аксоны следуют на ранних и поздних стадиях эмбриогенеза в различных регионах мозга. Эта стратегия способствует передовые методы таргетинга интерес клетки в эмбриональном мозге и траCING схемы формирования на различных стадиях развития.

Этот протокол был недавно использован, чтобы раскрыть аксонов модели и проекции сайтах dA1 подгруппе интернейронов в заднем мозге цыпленок 10. Чтобы специфично метить эти аксонов, энхансер (Atoh1), который ранее был охарактеризован как специфичные для нейронов спинного dI1 8,12,13, б...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo at JoVE.com

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Как нейронных сетей устанавливаются в эмбриональном мозге является фундаментальным вопросом в развитии нейробиологии. Здесь мы объединили метод электропорации с новых генетических инструментов, таких как Cre / LOX-плазмиды и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в заднем мозге птичьего маркировать интернейронов спинного и отслеживать их аксональное прогнозы и синаптических целей на различных стадиях развития.

Электропорации Hindbrain Трейс аксонов траектории и Synaptic Цели у эмбрионов кур

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Маркировка и работы с изображениями Ячейки в задний мозг данио рерио

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Производство Чик извлечение эмбрионов для выращивания мышей нервных стволовых клеток Крест

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Использование рГлуорин для оценки динамики аксонов Руководящие рецепторы в клеточной культуре и в Чик эмбриона

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология<em&gt; В Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Одновременная Двухфотонное<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Использование трассировки Eyeblink классический подготовлять для оценки гиппокампа дисфункции в мышиной модели плода алкоголь спектра расстройств

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Использование синаптических цинка гистохимии выявить различные регионы и пластинки в развивающихся, так и взрослого мозга

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Сочетание Оптогенетика с искусственных микроРНК охарактеризовать последствия нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...