Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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这项工作的经费是由国家健康与医学研究委员会，澳大利亚（NHMRC项目赠款1011352 MEC和澳门赛马会，独立研究机构基础设施支援计划IRIISS拨款，以WEHI）和维多利亚州政府（VESKI创新奖学金MEC;维多利亚州政府运营基础设施的支持WEHI）。 MEC是一个英国女王伊丽莎白二世的澳大利亚研究委员会研究员。 EFXB承认，从诺玛·希尔达·舒斯特在墨尔本大学的奖学金的支持。

1。克隆的结构和设计感兴趣的序列克隆到PMM-肽用HindIII和BamHI限制性位点（参见图1）的载体（可以按要求提供）。按以下顺序：一个HindⅢ位点的双链DNA，插入应纳入CNBr裂解; E 的一个单一的蛋氨酸密码子大肠杆菌密码子优化的编码序列的肽，一个终止密码子，一个BamHⅠ位点。应消除所有其他的肽中的蛋氨酸和二肽序列天冬 - 亲应避免，因为它也可以?...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains.">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li><li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus.">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li><li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

根据我们的经验， 表达的融合trpLE-TM。trpLE-TM融合低表达丰富的培养基中在37℃下，和这里所描述的培养条件为许多不同的序列，含有一至四个TM域，产率范围已证明是成功的为50〜150 mg / L的纯的，完整的融合。融合编码三-或四-TM G蛋白偶联受体片段（人CCR5 TM1-TM3和TM4-TM7分别）或人类信号肽肽酶（4 TM域;见文献15）的芯催化片段代表在此范围内的最低的表达的水平，而这里所使用的序...

该协议的细节一个过程中，我们已开发生产出二硫键稳定的复合物的跨膜肽（TM）采用溶液NMR结构研究。这个过程需要利用所提供的强大的表达ΔtrpLE1413融合系统（见下文），并允许使用先进的稳定同位素标记技术，现代化的多维NMR实验TM肽复合物的定义组成。我们采用这些技术来确定的NMR结构淋巴细胞活化免疫受体如何从多个膜蛋白亚基组装TM域之间的相互作用（1）最近检讨发现重要的新信息。这些技术适用于许多其他的膜蛋白的系统，以及广泛的下游除了溶液的NMR分析方法。虽然这里给出的例子利用本地的半胱氨酸残基创建一个复杂的，模仿自然的二硫键键合的蛋白，设计是同样适合于创建工程二硫键稳定的复合物，通常是由较弱，均聚物和杂二聚体TM配合物的非共价相互作用，如保持在一起表皮生长因子受体（EGFR）家族蛋白2-4或异源二聚体αβ整合复合物5,6。 非常疏水的肽序列，如那些来自脂质双层跨越TM蛋白的部分是极为困难的课题，生物化学和生物物理研究。除了是非常具有挑战性的操作使用标准的蛋白质和多肽化学技术，他们往往对细胞的毒性，因此难以产生重组。我们7,8和9-11有显着的成功表达这样的困难在细菌的肽序列帧中的羧基端来自大肠杆菌的修改版本的ΔtrpLE1413序列融合到大肠杆菌色氨酸操纵12。 〜13 kDa的trpLE由该序列编码的多肽可以在T7启动子下的高的水平，并产生完全定位于包涵体的问题有关的毒性和/或不稳定的规避。该序列通过加入一种氨基末端9-组氨酸标记13和消除从trpLE序列内部蛋氨酸和半胱氨酸残基，14允许trpLE-肽融合到由金属离子亲和层析法进行纯化和消化使用溴化氰（CNBr改性），以释放所需的肽序列。我们已经成功地使用这个系统来表达更多的十几家不同序列的trpLE融合膜蛋白片段包含多达四个TM域名（7,8和未公布结果;也见讨论部分）。 “在本协议中的关键创新是确定的条件下，其中的的非结构化和难溶trpLE-TM融合可以有效地二硫键交联的背景下，一个精简的工作流程。高收益的表达，处理和纯化的多肽产品的几个方面也得到了彻底的优化，这里提出的建议同样适用于非二硫键交联（单体）TM肽产品的生产。

<table border="1"><tbody><tr><td> 的试剂/材料名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴化氰</td><td> ALDRICH </td><td> P.No，CAS-506-C91492-68-3 </td><td> 有害物质。危险品。非常吸入毒性，与皮肤接触和吞食。与酸接触会产生剧毒气体。对水生生物有剧毒，可能对水生环境造成长期的不良影响。 </td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE 1000984387，CAS编号76-05-1 </td><td> 有害物质。危险品，造成严重灼伤。吸入有害。对水生生物有害，可能对水生环境造成长期的不良影响。 </td></tr><tr><td> 2 - 巯基乙醇</td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154，CAS编号60-24-2 </td><td> 有害物质。危险品 。吸入，皮肤接触及若食入。对皮肤有刺激性。严重伤害眼睛的危险。皮肤接触可能引起过敏。对水生生物有剧毒，可能对水生环境造成长期的不良影响。 </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3 - 六氟-2 - 丙醇</td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td>产品编号52512，CAS编号。 920-66-1 </td><td> 有害物质。危险品 。吸入有害，如果吞食。引致灼伤。 </td></tr><tr><td>蚁酸</td><td>默克</td><td> K41186564 </td><td>易燃液体和蒸气。造成严重皮肤灼伤和眼损伤。 </td></tr><tr><td>尿素</td><td> UNIVAR，AJAX FINECHEM </td><td>产品型号，817，CAS编号57-13-6 </td><td>当加热时，十二月omposes二氧化碳和氨;如果烧掉，发出少量的氮氧化物。会导致红肿和刺激皮肤和眼睛。 </td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td> AMRESCO </td><td> P.No-M110，CAS号码：50-01-1 </td><td>如果吞下将是有害的，造成严重眼刺激，使皮肤有刺激性，急性口服毒性，皮肤刺激性，对眼睛有刺激性。 </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td>产品编号T8532 CAS编号：9002-93-1 </td><td>的Triton X-100是一种非离子洗涤剂，100％活性成分，通常被用在以溶解蛋白质的生化应用。的Triton X-100具有无抗菌性能，并考虑了相对温和的非变性洗涤剂</td></tr><tr><td>他选择镍亲和凝胶</td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td>产品目录号P6611 </td><td> IS-选择镍亲和凝胶是一种固定化金属离子亲和层析（IMAC）产品。他的选择尼克EL亲和凝胶是一种专有的四齿螯合，组氨酸含有蛋白质的特异性结合，目的是用镍珠状琼脂糖收取。 </td></tr><tr><td> （ - ） - 谷胱甘肽，氧化</td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td>目录NUM 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000超声波仪</td><td> QSONICA </td><td> S-3000（已停产） </td><td>最大功率输出600瓦。 2英寸可更换的尖探针采用2英寸的高强度，高容量的提示和一系列的高强度，低容量的提示。最近的机型，目前该公司的Q500和Q700。 </td></tr><tr><td> RP-HPLC：生物DuoFlow层析系统，软件5.3版</td><td> Bio-Rad公司实验室</td><td>目录编号760-0047，配置编号：AU500571，序列号：484BR3705 </td><td>肽结合反相HPLC色谱柱在高AQueous流动相，洗脱RP HPLC柱高有机流动相。在反相高效液相色谱法分离的肽根据其疏水性。肽可通过运行的有机溶剂的线性梯度分离。 </td></tr><tr><td>准备HT C3 ZORBAX 300SB分析HPLC柱，21.2×150毫米，5微米的颗粒大小</td><td>安捷伦</td><td>产品编号：895150-909 </td><td>反相HPLC柱</td></tr><tr><td>的NuPAGE 12％的Bis-Tris凝胶</td><td> Life Technologies公司</td><td> NP0341BOX </td><td>前投凝胶蛋白电泳</td></tr><tr><td>幻灯片-A仪G2透析的带3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific的</td><td>产品编号：87724 </td><td>样品透析</td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

脂质嵌入的膜蛋白，α-螺旋结构域之间的物理相互作用起着至关重要的作用，在膜蛋白复合体的折叠和装配和跨膜（TM）信令和细胞表面蛋白水平的调节，例如动态过程。了解这些关联的特定序列的结构特点，需要复杂的生物物理和生物化学分析TM肽复合物。然而，TM域的极端疏水性使得它们非常难以操纵使用标准的肽化学技术，生产合适的学习材料常常被证明是令人望而却步具有挑战性的。确定的条件下，肽可以采用稳定的螺旋构象，并形成复合物， 自发地增加了更深一层的难度。在这里，我们提出了一种程序，均聚物或杂二聚体TM肽复合物，从材料的生产是在大肠杆菌中表达的关口，从而允许稳定同位素标签用于核磁共振（NMR）或其他应用程序相对廉价的非天然存在的氨基酸的掺入。在此方法中的关键的创新是作为共价结合 （二硫键交联的）组件改组为洗涤剂，脂质或其他膜-模拟物时，可以形成稳定的，化学计量的和均质的结构，TM配合物的生产和纯化。我们还提出了精心优化的程序也同样适用，无论是生产单TM域或交联复合物的表达和纯化，并提供这些方法来适应新的TM序列的意见。

trpLE融合实现的表达水平是可变的和严重依赖于连接的肽的氨基酸序列， 图3示出了预诱导的SDS-PAGE分析（泳道1）和时间的收获（泳道2）从文化，取得了约120毫克的纯的，完整trpLE DAP12TM融合从1升的文化和4毫升镍基样品。所有的trpLE DAP12TM融合的定位包涵体的沉淀（泳道4），而不是为上清液（泳道3）。 约70％的镍-纯化trpLE DAP12TM融合是二硫键交联的二聚体形式（ <...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

膜嵌入蛋白结构域之间的相互作用的生物物理和生物化学的研究面临许多技术上的挑战，首先是获得适当的学习材料。本文描述了一种用于生产和纯化二硫键稳定的的跨膜肽复合物，是适合用于结构分析通过溶液的核磁共振（NMR）和其他的分析应用的协议。

生产二硫键稳定的跨膜肽复合物的结构研究

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

表面钝化单分子蛋白质研究

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

科研

化学

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

稳态，稳定前的状态，单营业额动力学测量DNA糖基化酶活性

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

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薄层色谱（TLC）分离和植物提取物的生物测定识别抗菌化合物

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

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镍/锌配合物介导的O-Carboxyanhydrides 的控制 Photoredox 环开聚合

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

稳定笼 Aziridinium 离子的制备及其开环 Azaheterocycles 的合成

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

观测 Photoresponsive 液晶结构动力学的新方法

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

综合结构质谱分析蛋白质结构和蛋白质配体配合物

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

微重力环境下高效太阳能氢气生产的实验方法

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...