Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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Le financement de ce travail est assuré par la National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC projet de subvention à 1011352 MEC et MJC; Independent Research Institutes programme de soutien des infrastructures [IRIISS] subvention à WEHI) et le gouvernement du Victoria (VESKI Innovation Bourse de MEC; gouvernement de l&#39;État de Victoria Soutien opérationnel Infrastructure à WEHI). MEC est une reine Elizabeth II Fellow de l&#39;Australian Research Council. EFXB reconnaît l&#39;appui du Programme des bourses d&#39;études Norma Hilda Schuster à l&#39;Université de Melbourne.

1. Le clonage et la conception Construct Cloner les séquences d&#39;intérêt dans le vecteur PMM-peptide (qui peut être fourni sur demande) en utilisant HindIII et sites de restriction BamHI (voir Figure 1). L&#39;insert d&#39;ADN double-brin doit intégrer, dans l&#39;ordre suivant: un site HindIII; un seul codon méthionine pour le clivage par CNBr; l&#39;E. coli codon optimisé séquence codant pour un peptide, un codon d&#39;arrêt, un site BamHI. Tous les autr...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. 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E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

Expression de trpLE-TM fusions. D&#39;après notre expérience, trpLE-TM fusions sont mal exprimé dans un milieu de culture riche à 37 ° C, et les conditions de culture décrites ici ont fait leurs preuves pour de nombreuses séquences différentes contenant de une à quatre domaines TM avec des rendements allant 50 à 150 mg / L de pur, de fusion intacte. Fusions encodage de trois ou quatre fragments TM RCPG (CCR5 humain TM1-TM3 et TM4-TM7, respectivement) ou un fragment de noyau catalytique de peptidase du...

Ce protocole détaille une procédure que nous avons développé pour produire des complexes disulfure stabilisées transmembranaire (TM) de peptides destinés à des études structurales par RMN solution. La procédure prend avantage de l&#39;expression robuste offerte par le système ΔtrpLE1413 fusion (voir ci-dessous) et permet des complexes peptidiques TM de composition définie pour être générés en utilisant des techniques sophistiquées d&#39;étiquetage des isotopes stables pour les modernes des expériences de RMN multidimensionnelles. Nous avons utilisé ces techniques pour déterminer les structures RMN plusieurs qui ont révélé de nouveaux renseignements importants sur la façon d&#39;activation des lymphocytes immunorécepteurs sont assemblées à partir de plusieurs sous-unités de protéines membranaires par des interactions entre leurs domaines TM (récemment revu à 1). Ces techniques sont applicables à de nombreux autres systèmes de protéines membranaires, ainsi que toute une gamme de méthodes analytiques en aval, en plus de RMN en solution. Bien que l&#39;exemple donné ici utilise des résidus cystéine nativespour créer un complexe qui imite la nature liaisons disulfure des protéines, le design est aussi bien adapté pour la création de ponts disulfures d&#39;ingénierie pour stabiliser des complexes qui sont normalement maintenues ensemble par des faibles, des interactions non covalentes comme homo-et hétéro-dimères complexes de MC Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-protéines de la famille ou des hétérodimères αβ 04.02 complexes intégrines 5,6. Extrêmement séquences peptidiques hydrophobes tels que ceux issus de la bicouche lipidique, couvrant des portions de protéines TM sont des sujets extrêmement difficiles pour les études biochimiques et biophysiques. En plus d&#39;être très difficile à manipuler à l&#39;aide de protéines standard et des techniques de chimie des peptides, ils sont souvent très toxiques pour les cellules et sont donc difficiles à produire par recombinaison. Nous et les autres 7,8 9-11 ont connu un succès important en exprimant ces séquences peptidiques difficiles chez les bactéries que dans le même cadre carboxy-terminalefusions avec une version modifiée de la séquence dérivée de la ΔtrpLE1413 E. coli opéron trp 12. Le polypeptide ~ 13 kDa trpLE codée par cette séquence peut être produite à des niveaux élevés en vertu d&#39;un promoteur T7 et est entièrement localisée à corps d&#39;inclusion où les problèmes liés à la toxicité et / ou d&#39;instabilité sont contournées. Modification de la séquence par l&#39;addition d&#39;un amino-terminale 9-histidine étiquette 13 et l&#39;élimination des résidus internes de méthionine et de cystéine de la séquence trpLE 14 souhaités trpLE-peptide fusions d&#39;être purifiés par des ions métalliques et la chromatographie d&#39;affinité digéré à l&#39;aide de bromure de cyanogène (CNBr ) pour libérer la séquence peptidique désirée. Nous avons utilisé avec succès ce système pour exprimer plus d&#39;une douzaine de séquences différentes sous forme de fusions trpLE représentant des fragments de protéines membranaires qui contiennent moins de quatre domaines TM (7,8 et résultats non publiés; voir également la section Discussion). Lainnovation majeure dans ce protocole est l&#39;identification des conditions dans lesquelles les non-structurées et très peu soluble trpLE-TM fusions peuvent être efficacement disulfure réticulé dans le contexte d&#39;un flux de travail optimisé. Plusieurs aspects de l&#39;expression à haut rendement, la manipulation et la purification des produits peptidiques ont également été soigneusement optimisé, ainsi que les recommandations présentées ici sont tout aussi pertinentes pour la production de disulfure non-réticulés (monomère) produits peptidiques TM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le bromure de cyanogène </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Très toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Le contact avec des acides, dégage un gaz très toxique. Très toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, numéro CAS 76-05-1 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES., Provoque de graves brûlures. Nocif par inhalation. Nocif pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, numéro CAS 60-24-2 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Irritant pour la peau. Risque de lésions oculaires graves. Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. Très toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Numéro de produit 52512, CAS-No. 920-66-1 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Nocif par inhalation et par ingestion. Provoque des brûlures. </td></tr><tr><td> L&#39;acide formique </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Liquide et vapeurs inflammables. Provoque des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires. </td></tr><tr><td> Urée </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Numéro de produit, 817, N ° CAS 57-13-6 </td><td> Lorsqu&#39;il est chauffé, decomposes de dioxyde de carbone et l&#39;ammoniac; si brûlé, émet de faibles quantités d&#39;oxydes d&#39;azote. Peut causer des rougeurs et irritations de la peau et les yeux. </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de guanidine </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Numéro CAS: 50-01-1 </td><td> Nocif en cas d&#39;ingestion, irritant pour les yeux graves, Provoque une irritation cutanée, la toxicité aiguë par voie orale, irritant pour la peau Irritant pour les yeux,. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Nombre-T8532 Produit N ° CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 est un détergent non ionique, 100% d&#39;ingrédient actif, qui est souvent utilisé dans des applications biochimiques pour solubiliser les protéines. Triton X-100 n&#39;a pas de propriétés antimicrobiennes et considéré comme un relativement doux détergent non dénaturant </td></tr><tr><td> Son-Sélect nickel-affinité sur gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogue Num-P6611 </td><td> EST-Select Gel affinité nickel est un métal immobilisé-ion chromatographie d&#39;affinité (CMAP) de produit. L&#39;Nick HIS-Selectel affinité gel est un chélate de propriété quadridentate sur billes d&#39;agarose chargé avec du nickel qui est conçu pour se lier spécifiquement des protéines contenant histidine. </td></tr><tr><td> (-)-Glutathion oxydé </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogue num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicateur </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (discontinué) </td><td> Puissance de sortie 600 watts. 1/2-inch remplaçable pointe de la sonde prend 1/2-inch forte intensité, haut volume conseils et une gamme de haute intensité et de faible volume conseils. Plus proches des modèles actuellement disponibles dans cette entreprise sont Q500 Q700 et. </td></tr><tr><td> Version du logiciel système de chromatographie BioLogic DuoFlow, 5,3: RP-HPLC </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catalogue Num 760-0047, No Config: AU500571, N ° de série: 484BR3705 </td><td> Peptides se lie d&#39;inverser la phase colonnes HPLC en haute aqueous phase mobile et sont élués des colonnes HPLC RP avec grande phase mobile organique. En RP HPLC des peptides sont séparés en fonction de leur caractère hydrophobe. Peptides peuvent être séparés par l&#39;exécution d&#39;un gradient linéaire de solvant organique. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analytique Colonne HPLC, 21,2 x 150 mm granulométrie de 5 um </td><td> Agilent </td><td> Pas de produit: 895150-909 </td><td> HPLC en phase inverse colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gels </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Gels pré coulés pour l&#39;électrophorèse des protéines </td></tr><tr><td> Slide-A-lyseur de cassettes de dialyse G2, 3,5 K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Pas de produit: 87724 </td><td> Dialyse échantillon </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interactions physiques entre les lipides incorporés hélice alpha domaines de protéines membranaires jouent un rôle crucial dans le repliement et l&#39;assemblage des complexes protéiques membranaires et dans des processus dynamiques tels que transmembranaire (TM) de signalisation et de régulation de la teneur en protéines de la surface cellulaire. Comprendre les caractéristiques structurelles de conduite de l&#39;association des séquences particulières nécessite des analyses sophistiquées biophysiques et biochimiques de complexes peptidiques TM. Cependant, l&#39;hydrophobie extrême de domaines TM rend très difficile à manipuler à l&#39;aide des techniques standard de chimie des peptides, et la production de matériel d&#39;étude approprié s&#39;avère souvent prohibitif difficile. Identifier les conditions dans lesquelles les peptides peuvent adopter des conformations hélicoïdales stables et forment des complexes ajoute spontanément un autre niveau de difficulté. Nous présentons ici un procédé pour la production d&#39;homo-ou hétéro-dimères complexes peptidiques TM à partir de matériaux qui sont exprimées dans E. coli, ce qui permet l&#39;incorporation de marqueurs isotopiques stables pour la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou non-naturelles des acides aminés pour d&#39;autres applications relativement peu de frais. La principale innovation de cette méthode est que les complexes de MC sont produites et purifiées comme covalente disulfure associés (réticulé) qui peuvent former des assemblages de structures stables, stoechiométrique et homogène après reconstitution dans un détergent, lipides ou d&#39;autres matériaux de membrane-mimétiques. Nous présentons également des procédures soigneusement optimisés pour l&#39;expression et la purification qui sont également applicables si la production de simples domaines TM ou complexes réticulés et donner des conseils pour adapter ces méthodes à de nouvelles séquences TM.

Le niveau d&#39;expression atteint des fusions trpLE est variable et dépend fortement de la séquence d&#39;acides aminés du peptide ci-joint. Figure 3 montre l&#39;analyse par SDS-PAGE de pré-induction (piste 1) et l&#39;heure de la récolte (piste 2) échantillons provenant d&#39;une culture qui a produit environ 120 mg de pur, intact trpLE-DAP12TM de fusion de 1 litre de culture et de 4 ml matrice de nickel. Tous de la fusion trpLE-DAP12TM a été localisé le corps d&#39;inclusion de pellets (pis...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l&#39;obtention de matériel d&#39;étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l&#39;analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d&#39;autres applications analytiques.

La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

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