Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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Und der Regierung von Victoria (VESKI Innovation Fellowship MEC; Finanzierung dieser Arbeit wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme [IRIISS] Zuschuss an WEHI NHMRC Projektförderung 1011352 zur MEC und MJC) vorgesehen ist; Victorian State Government Operational Support der Infrastruktur, um WEHI). MEC ist ein Queen Elizabeth II Fellow des Australian Research Council. EFXB dankt für die Unterstützung aus der Norma Hilda Schuster Scholarship Program an der University of Melbourne.

Ein. Klonierung und Construct Design- Klonen die Sequenzen von Interesse in der PMM-Peptid-Vektor (die auf Wunsch zur Verfügung gestellt werden) mit HindIII und BamHI Restriktionsstellen (siehe Abbildung 1). Die doppelsträngige DNA-Insert sollte aufzunehmen, in der folgenden Reihenfolge: eine HindIII-Stelle; eine einzige Codon für Methionin CNBr-Spaltung, die E. coli-Codon-optimierte kodierende Sequenz, einen Stoppcodon, eine BamHI-Stelle. Alle anderen Methionine i...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. 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E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

Die Expression von trpLE-TM Fusionen. Nach unserer Erfahrung sind trpLE-TM Fusionen schlecht in eine reiche Kultur-Medium bei 37 ° C angegeben, und die Kultur hier beschriebenen Bedingungen bewährt für viele verschiedene Sequenzen mit 1-4 Transmembrandomänen mit Ausbeuten bis hin bewährt haben 50 bis 150 mg / l reines, intaktem Fusionsprotein. Fusions-Codierung Drei-oder Vier-TM GPCR Fragmente (TM1-humanen CCR5 TM3 und TM4-TM7 bezeichnet) oder ein Kern katalytisches Fragment von menschlichem Signalpeptidpe...

Dieses Protokoll Angaben eine Prozedur entwickelten wir zu Disulfid-stabilisierten Komplexe von Transmembran (TM)-Peptide für strukturelle Untersuchungen mittels NMR-Lösung zu erzeugen haben. Das Verfahren nutzt die Expression durch die robuste ΔtrpLE1413 Fusionssystem (siehe unten) ergab und ermöglicht TM-Peptid-Komplexe mit definierter Zusammensetzung zu erzeugenden mit hochentwickelten stabilen Isotopen Markierungstechniken für moderne mehrdimensionalen NMR-Experimente werden. Wir haben diese Techniken eingesetzt werden, um mehrere NMR-Strukturen, die wichtige neue Informationen darüber, wie Lymphozyten-Aktivierung Immunrezeptoren werden aus mehreren Membran-Protein-Untereinheiten durch Interaktionen zwischen ihren TM-Domänen zusammengesetzt (kürzlich in 1 bewertet) ergab bestimmen. Diese Techniken sind auf viele andere Membranprotein Systeme sowie einer Vielzahl von nachgeschalteten analytischen Methoden zusätzlich zur Lösung NMR. Während die hier angegebene Beispiel nutzt nativen Cysteinresteum einen Komplex, der die natürliche Disulfid-gebundenen Proteins nachahmt, das Design ist gleichermaßen gut für die Erstellung von engineered Disulfidbindungen, um Komplexe, die normalerweise miteinander durch schwächere, nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie Homo-und Hetero-dimeren TM Komplexe stabilisieren geeignet gehaltene epidermal growth factor receptor (EGFR)-Familie Proteinen 2-4 oder heterodimeren αβ Integrin-Komplexen 5,6. Extrem hydrophoben Peptidsequenzen wie die von der Lipid-Doppelschicht abgeleitet umspannenden Teile TM Proteine ​​sind äußerst schwierige Themen für biochemische und biophysikalische Studien. Zusätzlich dazu, dass sehr schwierig zu manipulieren Verwendung von Standard-Protein-und Peptidchemie Techniken, sind sie oft ziemlich toxisch für Zellen und sind daher schwer rekombinant herzustellen. Wir 7,8 und andere 9-11 gehabt haben bedeutende Erfolge Ausdruck solch schwierigen Peptidsequenzen in Bakterien als in-frame carboxyterminalenFusionen mit einer modifizierten Version des ΔtrpLE1413 Sequenz aus dem E. abgeleitete coli trp Operon 12. Die ~ 13 kDa Polypeptid trpLE von dieser Sequenz codierten können in hohen Konzentrationen unter einem T7-Promotor erzeugt werden und vollständig in Einschlusskörpern, wo Probleme bezüglich Toxizität und / oder Instabilität umgangen lokalisiert. Modifikation der Sequenz durch Hinzufügen einer Amino-terminalen Histidin-Tag 9-13 und Eliminierung von internen Methionin und Cystein-Reste aus der Sequenz 14 trpLE erlaubt trpLE-Peptid-Fusionen durch Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigt werden und verdaut mit Cyanogenbromid (CNBr ), um den gewünschten Peptidsequenz. Wir haben erfolgreich dieses System verwendet, um mehr als ein Dutzend verschiedene Sequenzen als trpLE Fusionen darstellen Membranprotein-Fragmente, die weniger als vier Transmembrandomänen enthalten und exprimieren (7,8 und unveröffentlichte Ergebnisse; siehe auch Abschnitt Diskussion). Diewichtige Neuerung in diesem Protokoll ist die Identifizierung von Bedingungen, unter denen die unstrukturierte und sehr schlecht löslich trpLE-TM Fusionen effizient im Rahmen eines optimierten Workflow Disulfid-vernetzt werden können. Mehrere Aspekte der Expression mit hoher Ausbeute, die Handhabung und Reinigung von Peptid Produkte wurden ebenfalls gründlich optimiert, und den Empfehlungen hier vorgestellten gleichermaßen relevant für die Produktion von Nicht-Disulfid-vernetztes (monomeren) TM Peptid Produkte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromcyan </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Sehr giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Berührung mit Säure sehr giftige Gase. Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, CAS-Nummer 76-05-1 </td><td> STOFF. Gefahrgut., Verursacht schwere Verätzungen. Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Schädlich für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, CAS-Nummer 60-24-2 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Reizt die Haut. Gefahr ernster Augenschäden. Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Product Number 52512, CAS-Nr. 920-66-1 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken. Verursacht Verätzungen. </td></tr><tr><td> Ameisensäure </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Flüssigkeit und Dampf entzündbar. Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Product Number, 817, CAS-Nr 57-13-6 </td><td> Beim Erhitzen Dezemberomposes zu Kohlendioxid und Ammoniak; wenn verbrannt, emittiert geringe Mengen von Stickoxiden. Kann Rötungen und Reizungen an Haut und Augen verursachen. </td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS-Nummer: 50-01-1 </td><td> Gesundheitsschädlich beim Verschlucken Verursacht schwere Augenreizung, Verursacht Hautreizungen, Akute Toxizität Oral, hautreizend, Eye Reizend. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Product Number-T8532 CAS Nr.: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 ist ein nichtionisches Detergens, 100% Wirksubstanz, die oft in biochemischen Anwendungen verwendet wird, um Proteine ​​löslich zu machen. Triton X-100 hat keine antimikrobielle Eigenschaften und prüft eine vergleichsweise milden nicht-denaturierenden Detergenz </td></tr><tr><td> His-Select Nickel-Affinity Gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Katalog Num-P6611 </td><td> IS-Select Nickel Affinity Gel ist ein immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) Produkt. Die HIS-Select Nickel Affinity Gel ist ein proprietäres vierzähnigen Chelat auf Perlen Agarose mit Nickel, die speziell für den binden Histidin enthaltenden Proteinen aufgeladen ist. </td></tr><tr><td> (-)-Glutathion, oxidiertem </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Katalog num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 Sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (eingestellt) </td><td> Max. Ausgangsleistung 600 Watt. 1/2-Zoll auswechselbaren-tip-Sonde nimmt 1/2-Zoll hoher Intensität, High-Volume-Tipps und eine Reihe von hoher Intensität, Low-Volume-Tipps. Closest derzeit verfügbaren Modelle dieser Firma sind Q500 und Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: BioLogic DuoFlow Chromatographie-System, Software Version 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Katalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 </td><td> Peptide bindet an HPLC-Säulen in hoher aq umkehrenueous mobile Phase und werden von RP-HPLC-Säulen mit hohen organischen mobilen Phase eluiert. In RP HPLC Peptide werden auf der Grundlage ihrer hydrophoben Charakter getrennt. Peptide können durch Ausführen eines linearen Gradienten von organischem Lösungsmittel abgetrennt werden. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analytische HPLC-Säule, 21,2 x 150 mm, 5 mm Korngröße </td><td> Agilent </td><td> Artikel-Nr: 895150-909 </td><td> Umkehrphasen-HPLC colum </td></tr><tr><td> 12% NuPAGE Bis-Tris-Gele </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Pre Gele für Protein-Elektrophorese </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Dialyse Kassetten, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Artikel Nr.: 87724 </td><td> Beispiel Dialyse </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Physikalische Wechselwirkungen zwischen den Lipid-eingebetteter Alpha-Helix-Domänen von Membranproteinen spielen eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Montage von Membranprotein-Komplexen und bei dynamischen Prozessen wie Transmembran (TM)-Signalisierung und Regelung Zelloberflächenprotein Ebenen. Das Verständnis der strukturellen Merkmale der Fahrt die Assoziation von bestimmten Sequenzen erfordert ausgefeilte biophysikalische und biochemische Analysen der TM-Peptid-Komplexe. Allerdings macht die extremen Hydrophobie Transmembrandomänen sie sehr schwierig zu handhaben Verwendung von Standard-Techniken der Peptidchemie, und Herstellung von geeigneten Lehrmaterial erweist sich oft als prohibitiv anspruchsvoll. Identifizieren Bedingungen, unter denen Peptide stabile helicale Konformationen und bilden Komplexe annehmen kann spontan fügt eine weitere Schwierigkeit. Hier stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Homo-oder Hetero-dimeren TM-Peptid-Komplexe aus Materialien, die in E. exprimiert werden coli, wodurch Einbau von stabilen Isotopenmarker für Kernspinresonanz (NMR) oder nicht-natürlichen Aminosäuren für andere Anwendungen relativ kostengünstig. Die wichtige Neuerung an diesem Verfahren ist, dass TM-Komplexe gebildet werden und gereinigt, wie kovalent assoziiert (Disulfid-vernetzt) ​​Anordnungen, die stabile, homogene stöchiometrische und Strukturen bilden können, wenn sie in Wasch-, Lipid oder eine andere Membran-mimetischen Materialien rekonstituiert. Wir präsentieren auch sorgfältig optimierten Verfahren zur Expression und Reinigung, die in gleicher Weise anwendbar, ob die Herstellung von ein TM-Domänen oder vernetzte Komplexe sind und beraten für die Anpassung dieser Methoden, um neue TM-Sequenzen.

Die Höhe der Ausdruck für trpLE Fusionen erreicht ist variabel und hängt stark von der Aminosäure-Sequenz der angehängten Peptid. Abbildung 3 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von Vorinduktion (Spur 1) und Time-of-Ernte (Spur 2) Proben aus einer Kultur, die ca. 120 mg reines, intakte trpLE-DAP12TM Fusionsprotein aus 1 Liter Kultur und 4 ml Nickelmatrix ergab. Alle der trpLE-DAP12TM Fusionsprotein wurde zu der Einschlusskörper Pellet (Spur 4), um Überstand (Bahn 3) gegenüberliegenden lokalisiert. <p...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Biophysikalische und biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen den membranständigen eingebettet Proteindomänen stehen viele technische Herausforderungen, von denen der erste Abschluß einer entsprechenden Studie Material ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Reinigung Disulfid-stabilisierten Transmembran-Peptid-Komplexe, die geeignet für die Strukturanalyse durch Lösungspolymerisation Kernspinresonanz (NMR) und andere analytische Anwendungen sind.

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Research

JoVE Journal

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