Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Health and Medical Research Council of Australia (sovvenzione di progetto NHMRC 1.011.352 di MEC e MJC, Independent Research Infrastructure Istituti Support Scheme [IRIISS] sovvenzione WEHI) e il Governo del Victoria (Veski Innovazione Fellowship per MEC; Victorian State Government Supporto Operativo Infrastrutture per WEHI). MEC è una Regina Elisabetta II del Fellow Research Council australiano. EFXB riconosce il sostegno del programma di borse di studio Norma Hilda Schuster presso l&#39;Università di Melbourne.

1. Clonazione e Design Construct Clonare le sequenze di interesse nella PMM-peptide vettore (che può essere fornita su richiesta) usando i siti di restrizione HindIII e BamHI (vedi Figura 1). Il doppio filamento di DNA dovrebbe includere, nel seguente ordine: un sito HindIII, un singolo codone metionina per clivaggio CNBr, la E. coli codone ottimizzato peptide sequenza codificante, un codone di stop, un sito BamHI. Tutti gli altri metionine nel peptide dovrebbe esser...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

Espressione di trpLE-TM fusioni. Nella nostra esperienza, trpLE-TM fusioni sono scarsamente espresse in mezzo di coltura ricca a 37 ° C, e le condizioni di coltura qui descritti sono dimostrate efficaci per molte differenti sequenze contenenti 1-4 domini TM con rese variabili 50-150 mg / L di puro, fusione intatta. Codifica Fusions tre o quattro frammenti TM GPCR (umano CCR5 TM1-TM3 e TM4-TM7, rispettivamente) o un frammento di nucleo catalitico umana peptidasi peptide di segnale (quattro domini TM; vedi rif <...

Questo protocollo dettagli una procedura che abbiamo sviluppato per la produzione di complessi disolfuro-stabilizzate di transmembrana (TM) peptidi per studi strutturali mediante NMR soluzione. La procedura si avvale dell&#39;espressione robusta offerta dal sistema ΔtrpLE1413 fusione (vedi sotto) e permette complessi peptide TM di composizione definita da generare utilizzando sofisticate tecniche di isotopi stabili-etichettatura per i moderni multi-dimensionali esperimenti NMR. Abbiamo utilizzato queste tecniche per determinare le strutture NMR più importanti che hanno rivelato nuove informazioni su come linfociti-attivazione immunoreceptors sono assemblati da più subunità delle proteine ​​di membrana attraverso interazioni tra i loro domini TM (recentemente rivisto in 1). Queste tecniche sono applicabili a sistemi a membrana molte altre proteine ​​così come una vasta gamma di metodi analitici valle oltre a NMR soluzione. Mentre l&#39;esempio qui utilizza residui di cisteina nativiper creare un complesso che imita la naturale disolfuro-legato proteina, il design è adatto sia per la creazione di legami disolfuro ingegnerizzati per stabilizzare complessi che sono normalmente tenuti insieme da deboli, interazioni non covalenti quali omo-e etero-TM complessi dimerici di recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR)-familiari proteine ​​2-4 o eterodimeri αβ complessi integrine 5,6. Sequenze peptidiche estremamente idrofobi come quelli derivati ​​dal doppio strato lipidico-spanning porzioni di proteine ​​TM sono soggetti estremamente difficile per studi biochimici e biofisici. Oltre ad essere molto difficile da manipolare utilizzando proteina standard e tecniche di chimica dei peptidi, sono spesso molto tossici per le cellule e sono quindi difficili da produrre ricombinante. Noi e gli altri 7,8 9-11 hanno avuto un significativo successo esprimere tali sequenze peptidiche difficili nei batteri come in-frame carbossi-terminalefusioni di una versione modificata della sequenza ΔtrpLE1413 derivata dalla E. coli operone trp 12. Il ~ 13 kDa polipeptide codificato da trpLE questa sequenza possono essere prodotti a livelli elevati sotto un promotore T7 ed è interamente localizzato corpi di inclusione in cui sono elusione problemi di tossicità e / o instabilità. Modifica della sequenza mediante aggiunta di un amino-terminale 9-istidina 13 e eliminazione dei residui interni metionina e cisteina dalla sequenza trpLE 14 ammessi trpLE-peptide fusioni essere purificati da ioni metallo cromatografia di affinità e digerito con bromuro di cianogeno (CNBr ) per rilasciare la sequenza peptidica desiderata. Abbiamo utilizzato con successo questo sistema per esprimere più di una dozzina di sequenze differenti come fusioni trpLE che rappresentano frammenti di proteine ​​di membrana che contengono fino a quattro domini TM (7,8 e risultati non pubblicati, vedere anche la sezione DISCUSSIONE). Ilinnovazione chiave in questo protocollo è l&#39;identificazione delle condizioni in cui i non strutturati e molto poco solubile trpLE-TM fusioni possono essere efficacemente disolfuro reticolato nel contesto di un flusso di lavoro ottimizzato. Diversi aspetti di alto rendimento di espressione, la manipolazione e la purificazione dei prodotti peptidici sono stati accuratamente ottimizzati, e le raccomandazioni qui presentate sono ugualmente rilevanti per la produzione di non-disolfuro-reticolati (monomerico) TM prodotti peptidici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromuro di cianogeno </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. A contatto con acidi libera gas molto tossico. Altamente tossico per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> CAP e-1000984387, Numero CAS 76-05-1 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE., Provoca gravi ustioni. Nocivo per inalazione. Nocivo per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, numero CAS 60-24-2 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per la pelle. Rischio di gravi lesioni oculari. Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Altamente tossico per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanolo </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Codice prodotto 52512, CAS. 920-66-1 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Nocivo per inalazione e ingestione. Provoca ustioni. </td></tr><tr><td> Acido formico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Liquido e vapori infiammabili. Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. </td></tr><tr><td> Urea </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Numero del prodotto, 817, CAS 57-13-6 </td><td> Una volta riscaldato, decomposes di biossido di carbonio e ammoniaca; se bruciato, emette piccole quantità di ossidi di azoto. Può causare arrossamento e irritazione della pelle e degli occhi. </td></tr><tr><td> Guanidina cloridrato </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Numero CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo per ingestione, Provoca grave irritazione oculare, Provoca irritazione cutanea, Tossicità acuta per via orale, irritante per la pelle, irritante per gli occhi. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Numero del prodotto-T8532 Numero CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 è un detergente non ionico, 100% di principio attivo, che viene spesso utilizzato in applicazioni biochimiche per solubilizzare le proteine. Triton X-100 non ha proprietà antimicrobiche e considerato relativamente mite non denaturante detergente </td></tr><tr><td> Il suo-Select Nichel-gel di affinità </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogo Num-P6611 </td><td> IS-Select Gel Affinity Il nichel è un metallo immobilizzato agli ioni di cromatografia di affinità (IMAC) del prodotto. La HIS-Select Nickel Affinity gel è un chelato proprietaria quadridentate su perline di agarosio carica di nichel, che è progettato per legarsi specificamente istidina contenente proteine. </td></tr><tr><td> (-)-Glutatione, ossidato </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogo num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicatore </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (fuori produzione) </td><td> Potenza massima 600 watt. 1/2-inch sostituibile-punta della sonda si 1/2-inch ad alta intensità, ad alto volume punte e una gamma di alta intensità, basso volume punte. Più vicine modelli attualmente disponibili da questa azienda sono Q500 e Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: doppio passaggio sistema biologico cromatografia, versione software 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catalogo Num 760-0047, Config No: AU500571, Numero di serie: 484BR3705 </td><td> Peptidi lega a fase inversa colonne HPLC in alta aqueous fase mobile e vengono eluite da RP colonne HPLC ad alta fase organica mobile. In RP HPLC peptidi sono separati in base al loro carattere idrofobo. Peptidi possono essere separati eseguendo un gradiente lineare del solvente organico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analitica HPLC Colonna, 21.2 x 150 mm, granulometria 5 micron </td><td> Agilent </td><td> No. del prodotto: 895150-909 </td><td> HPLC in fase inversa Colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gel </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Gel del cast Pre per elettroforesi delle proteine </td></tr><tr><td> Slide-A-lizzatore cassette dialisi G2, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> No. del prodotto: 87724 </td><td> Esempio di dialisi </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interazioni fisiche tra i lipidi incorporati alfa-elica domini di proteine ​​di membrana svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento e assemblaggio di complessi proteici di membrana e in processi dinamici quali transmembrana (TM) di segnalazione e regolazione della superficie cellulare proteina livelli. Comprendere le caratteristiche strutturali di guida l&#39;associazione di particolari sequenze richiede sofisticate analisi biofisiche e biochimiche dei complessi peptide TM. Tuttavia, l&#39;idrofobicità estrema domini TM rende molto difficile da manipolare utilizzando tecniche standard di chimica dei peptidi, e la produzione di materiale idoneo studio dimostra spesso proibitivo impegnativo. Identificare le condizioni in base alle quali i peptidi possono adottare conformazioni elicoidali stabili e formano complessi spontaneamente aggiunge un ulteriore livello di difficoltà. Presentiamo qui un procedimento per la produzione di omo-o etero-dimeri peptide TM da materiali che sono espressi in E. coli, consentendo incorporazione di etichette isotopi stabili per risonanza magnetica nucleare (NMR) o amminoacidi non naturali per altre applicazioni relativamente a buon mercato. L&#39;innovazione principale di questo metodo è che i complessi TM vengono prodotti e purificato come covalentemente associate disolfuro (reticolato) gruppi che possono formare strutture stabili, e stechiometrica omogenea quando ricostituito in detergente, o altri lipidi di membrana-mimetici materiali. Presentiamo anche scrupolosamente alle procedure ottimizzate per l&#39;espressione e la purificazione che sono ugualmente applicabili se la produzione di singoli domini TM o complessi reticolati e fornire consigli per adeguare tali metodi per nuove sequenze TM.

Il livello di espressione ottenuto per fusioni trpLE è variabile e dipende fortemente dalla sequenza di aminoacidi del peptide allegata. Figura 3 mostra l&#39;analisi SDS-PAGE di pre-induzione (corsia 1) e il tempo di raccolta (corsia 2) campioni provenienti da una cultura che ha prodotto circa 120 mg di pura, intatta trpLE-DAP12TM fusione da 1 litro di coltura e 4 matrice di nichel ml. Tutto il trpLE-DAP12TM fusione era localizzata all&#39;inclusione corpo pellet (corsia 4) rispetto al supernatante (c...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l&#39;analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.

Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

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