Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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とビクトリア州政府（MECへVESKIイノベーションフェローシップ;、この仕事のための資金は、オーストラリアの国立保健医療研究評議会（独立研究機関インフラ支援スキーム[IRIISS]助成WEHIへNHMRCプロジェクト無償1011352 MECおよびMJCの）によって提供されWEHIにビクトリア州政府インフラ運用·サポート）。 MECは、オーストラリアの研究評議会のエリザベス女王二世·フェローでもある。 EFXBは、メルボルン大学のノーマヒルダシャスター奨学金プログラムからの支援を認めている。

1。クローニングおよびコンストラクトのデザイン HindIIIとBamHI制限部位を用いて、PMM-ペプチドベクター（リクエストに応じて提供することができます）（ 図1参照）に興味のある配列をクローン。 ;のCNBr切断のための単一のメチオニンコドン、E. HindIII部位：二本鎖DNAの挿入は、次の順序で、取り入れるべきコード配列を大腸菌コドン最適化ペプ?...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains.">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li><li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus.">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li><li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

trpLE-TM融合の発現は我々の経験では、trpLE-TM融合が不十分37℃で豊かな培養培地中で表現され、ここに記載の培養条件は、利回りが及ぶと一から四、TMドメインを含有する多くの異なるシーケンスのために成功した証明した50〜150ミリグラム/純粋、無傷の融合のL。 3つまたは4つのTMのGPCRの断片（それぞれヒトCCR5 TM1〜TM3とTM4-TM7、）またはヒトシグナルペプチドペプチダーゼのコア触媒断...

このプロトコルは、細部私達は溶液NMRを用いた構造研究のための膜貫通（TM）ペプチドのジスルフィド安定な錯体を生成するために開発した手順を実行します。手順は、ΔtrpLE1413融合システムによってもたらされる堅牢な表現を利用しています（下記参照）と定義された組成のTMペプチド複合体は、現代の多次元NMR実験のために洗練された安定同位体標識技術を使用して生成することができます。私たちは、リンパ球活性化免疫受容体が（最近1日）は、TMドメイン間の相互作用を介して複数の膜タンパク質サブユニットから組み立てられる方法に関する重要な新情報が明らかになったいくつかのNMR構造を決定するためにこれらの技術を採用してきた。これらの技術は、他の多くの膜タンパク質のシステムだけでなく、溶液NMRに加え下流の分析方法の広い範囲に適用されます。ここに示す例では、ネイティブのシステイン残基を利用している間自然にジスルフィド結合タンパク質を模倣する複合体を作成するために、デザインを使用しても同様に、通常、そのようなホモとのヘテロ二量体TM複合体として弱く、非共有結合性相互作用によって一緒に保持されている複合体を安定化するために設計されたジスルフィド結合を作成するのに最適です上皮成長因子受容体（EGFR）ファミリータンパク質2-4またはヘテロαβインテグリン錯体5,6。 そのようなTMのタンパク質の脂質二重膜貫通部分に由来するもののような非常に疎水性のペプチド配列は、生化学的および生物物理学的研究のために非常に困難な課題である。標準タンパク質およびペプチド化学技術を用いて操作することは非常に困難であることに加えて、彼らはしばしば細胞に非常に有毒であり、したがって、組換え的に生成することは困難である。我々 7,8と他人9-11カルボキシ末端フレームのような細菌で、このような困難なペプチド配列を発現させる重要な成功を収めている大腸菌由来ΔtrpLE1413シーケンスの修正版への融合大腸菌trpオペロン12。この配列によってコードされるポリペプチドtrpLE〜13 kDaのは、T7プロモーターの下で高いレ​​ベルで製造することができると完全に毒性および/または不安定性に関連する問題が回避され、封入体に局在する。 trpLE配列からアミノ末端9 -ヒスチジンタグ13と内部メチオニンおよびシステイン残基の除去14許さtrpLE-ペプチド融合体は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、臭化シアン（CNBrを使用して消化するの添加による配列の改変）は、所望のペプチド配列を解放します。我々は、正常に、最大4つのTMのドメインを（;また、ディスカッションのセクションを参照してください7,8および未発表の結果）が含まれている膜タンパク質の断片を表すtrpLE融合としてダース以上の異なる配列を発現させるためにこのシステムを使用している。 ザこのプロトコルでは鍵の技術革新は、構造化されていないと非常に難溶性trpLE-TMの融合を効率的に合理化されたワークフローのコンテキスト内でジスルフィド架橋することができる条件の同定である。高収量の発現、取扱い及びペプチド生成物の精製のいくつかの側面も徹底的に最適化されており、ここに示した推奨事項は、非ジスルフィド架橋（モノマー）TMペプチド製品の生産のために均等に関連しているされています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>臭化シアン</td><td>アルドリッチ</td><td> P.No-C91492、CAS-506-68から3 </td><td> 有害物質。危険貨物。猛毒吸入、飲み込んだり皮膚に接触したり。酸と接触すると、非常に有毒なガスを発生する。水生生物に非常に有毒で、水生環境に長期にわたり悪影響を与える恐れがあります。 </td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P.CODE-1000984387、CAS番号76-05-1 </td><td> 有害物質。危険物とは。、重度の火傷を起します。吸入すると有害。水生生物に対して有害、水生環境中で長期にわたり悪影響を与える恐れがあり。 </td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P.No M7154、CAS番号60-24-2 </td><td> 有害物質。危険貨物 。吸入、皮膚に接触すると飲み込むと有毒。皮膚を刺激する。眼に重傷のおそれ。皮膚接触により感作を引き起こすことがあります。水生生物に非常に有毒で、水生環境に長期にわたり悪影響を与える恐れがあります。 </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3 - ヘキサフルオロ-2 - プロパノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>製品番号52512、CAS番号。 920-66-1 </td><td> 有害物質。危険貨物 。吸入すると有害と飲み込む。火傷を起します。 </td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>メルク</td><td> K41186564 </td><td>引火性の高い液体および蒸気。重篤な皮膚の薬傷·眼の損傷。 </td></tr><tr><td>尿素</td><td> Univarのは、AJAXファインケム</td><td>製品番号、817、CAS番号57-13-6 </td><td>加熱され、12月二酸化炭素とアンモニアにomposes;燃やした場合、窒素酸化物の少量を発する。発赤、皮膚や目の炎症を引き起こすことができます。 </td></tr><tr><td>塩酸グアニジン</td><td> Amresco </td><td> P.No-M110、CAS番号：50-01-1 </td><td>飲み込むと有害、重篤な眼の炎症を起こす、皮膚の炎症、急性毒性経口、皮膚刺激、眼刺激を引き起こす。 </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td>製品番号T8532-CAS番号：9002-93-1 </td><td>トリトンX-100は、非イオン性界面活性剤、しばしばタンパク質を可溶化するために生化学的な用途で使用される100％の活性成分である。トリトンX-100は抗菌特性を持っていない、比較的軽度の非変性洗剤を考慮</td></tr><tr><td>彼のセレクトニッケルアフィ​​ニティーゲル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>カタログのNum-P6611 </td><td> IS-セレクトニッケルアフィ​​ニティーゲルは、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）製品です。 HISセレクトニックエルアフィニティゲルは特にヒスチジン含有タンパク質を結合するように設計されているニッケルで起訴ビーズアガロース上で独自の四座キレートである。 </td></tr><tr><td> （ - ） - グルタチオン、酸化された</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>カタログNUM 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000ソニケーター</td><td> QSONICA </td><td> S-3000（販売終了） </td><td>最大出力600ワット。 2インチ交換可能なチップ·プローブは、2インチの高輝度、高ボリュームのヒントや、高輝度、低ボリュームのヒントの範囲をとります。この会社の現在利用​​可能な最も近いモデルは、Q500とQ700です。 </td></tr><tr><td> RP-HPLC：生物学的DuoFlowクロマトグラフィーシステム、ソフトウェアバージョン5.3 </td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズ</td><td>カタログヌム760-0047は、Configいいえ：AU500571、シリアル番号：484BR3705 </td><td>ペプチドは高い水溶液に相HPLCカラムを逆に結合するueous移動相と高有機移動相でのRP HPLCカラムから溶出される。 RP HPLCでペプチドは、疎水性の特徴に基づいて分離されています。ペプチドは、有機溶剤の直線勾配を実行することによって分離することができる。 </td></tr><tr><td>プレップHT C3 ZORBAX 300SB-分析用HPLCカラム、21.2×150 mmの5μmの粒径</td><td>アジレント</td><td>製品番号：895150から909 </td><td>逆相HPLCコラム</td></tr><tr><td> NuPAGE 12パーセントBis-Trisゲル</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> NP0341BOX </td><td>タンパク質電気泳動のための事前キャストゲル</td></tr><tr><td>スライド-A-アナライザG2の透析カセット、3.5K MWCO </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>製品番号：87724 </td><td>サンプル透析</td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

膜タンパク質の脂質埋αヘリックスドメイン間の物理的相互作用は、膜タンパク質複合体のフォールディングおよびアセンブリに、このような膜貫通（TM）シグナリングと細胞表面のタンパク質レベルの規制などの動的過程において重要な役割を果たしています。特定の配列の関連付けを駆動する構造的特徴を理解することは、TMのペプチド複合体の洗練された生物物理学的および生化学的解析を必要とします。しかし、TMドメインの極端な疎水性は、標準的なペプチド化学の技術を使用して操作するためにそれらを非常に困難にし、適切な勉強材料の​​生産は、多くの場合、法外にやりがいを証明している。ペプチドは、安定した螺旋状のコンフォメーションとフォーム複合体を採用することができる条件を特定することは、 自発的に難易度のさらなるレベルを追加します。ここで我々は、 大腸菌で発現される材料からホモまたはヘテロ二量体のTMペプチド複合体を製造するための手順を紹介鞍部私は、このように比較的安価に核磁気共鳴（NMR）やその他のアプリケーション用の非天然アミノ酸のための安定同位体標識の取り込みを可能にします。この方法で重要な技術革新は、TM複合体が生成され、洗剤、脂質又は他の膜模倣材料に再構成したとき、安定した化学量論的で均質な構造を形成することができる共有結合 （ジスルフィド架橋）アセンブリのように精製されていることである。我々はまた、単一のTMドメインまたは架橋錯体を生成するかどうかも同様に適用可能であり、新しいTMシーケンスにこれらのメソッドを適応させるためのアドバイスを提供発現および精製のために慎重に最適化された手順を紹介します。

trpLE融合に達成発現のレベルは、変数および接続されたペプチドのアミノ酸配列に大きく依存しています。 図3に示すプレ誘導のSDS-PAGE分析（レーン1）とTime-of-収穫（レーン2）文化の1リットルと4ミリリットルのニッケルマトリックスからの純粋な、無傷trpLE-DAP12TM融合の約120 mgを得た培養物からのサンプル。上清（レーン3）とは対照的に、trpLE-DAP12TM融合のすべてが封入体ペレッ?...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

膜に埋め込まれたタンパク質ドメイン間の相互作用の生物物理学的および生化学的研究は多くの技術的課題は、適切な教材を入手されているの最初に直面しています。この記事では、ソリューションの核磁気共鳴（NMR）およびその他の分析アプリケーションによる構造解析に適しているジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体を製造し、精製するためのプロトコルについて説明します。

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

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Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

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薄層クロマトグラフィー（TLC）分離および植物抽出物のバイオアッセイは、抗菌化合物を同定するために

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

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OCarboxyanhydrides ニッケル/亜鉛錯体による媒介のユウロピウムの開環重合

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

安定した二環性 Aziridinium イオンと開環の Azaheterocycles の合成のための準備

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

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We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

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微小重力環境における効率的な太陽水素製造のための実験方法

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