Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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멕과 빅토리아 정부 (VESKI 혁신 동지,이 작품에 대한 자금 지원은 국민 건강과 호주의 의학 연구위원회 (WEHI에 독립적 인 연구소 인프라 지원 계​​획은 [IRIISS] 부여 멕과 MJC에 NHMRC 프로젝트 보​​조금 1,011,352)에 의해 제공된다; WEHI에 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원). 멕는 호주 연구 협의회의 엘리자베스 2 세 여왕 동지이다. EFXB는 멜버른 대학에서 노마 힐다 슈스터 장학금 프로그램의 지원을 인정합니다.

1. 복제 및 구조 설계 HindIII와 BamHI 제한 사이트를 (그림 1 참조)를 사용하여 pMM-펩타이드 벡터 (이 요청시 제공 될 수 있습니다)에 관심 시퀀스를 복제. 이중 좌초 된 DNA의 삽입은 다음과 같은 순서로, 통합해야 HindIII 사이트, CNBr의 절단에 대한 단일 메티오닌 코돈, E.를 순서를 코딩 대장균 코돈 최적화 된 펩타이드, 정지 코돈, BamHI 사이트입니다. 펩타?...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. 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trpLE-TM fusions의 표현이 있습니다. 우리의 경험에서 trpLE-TM fusions이 저조한 37 ° C에서 풍부한 문화 매체에 표현되며, 여기에 설명 된 문화 조건 수율이 범위를 1-4 TM 도메인에서 포함 된 다양한 시퀀스에 대해 성공적으로 증명 50에서 150 밀리그램 / 순수 그대로 융합의 L. Fusions 인코딩은 세 또는 네 TM GPCR 조각 (인간의 CCR5 각각 TM1-TM3 및 TM4-TM7), 또는 인간의 신호 펩티드 peptidase (4 TM 도메인, 심판 ...

이 프로토콜은 세부 사항 우리가 솔루션 NMR을 사용하여 구조 연구 이황화 - 안정화 transmembrane의 단지 (TM) 펩티드를 생성하기 위해 개발 절차를. 절차는 ΔtrpLE1413 융합 시스템 (아래 참조)에 의해 부여 강력한 표현을 활용하여 정의 된 구성의 TM의 펩타이드 단지는 현대적인 다차원 NMR 실험에 사용되는 복잡한 안정적-동위 원소의 분류 기술을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 우리는 림프구 - 활성화 immunoreceptors이 (최근 1 검토)은 TM 도메인 간의 상호 작용을 통해 여러 막 단백질 subunits에서 조립하는 방법에 대한 중요한 새로운 정보를 공개 여러 NMR 구조를 결정하기 위해 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 이 기술은 다른 많은 막 단백질 시스템뿐만 아니라 솔루션 NMR뿐만 아니라 다운 스트림 분석 방법의 다양한 적용됩니다. 여기에 주어진 예는 기본 시스테인 잔류 물을 활용하는 동안자연스럽게 이황화 - 보세 단백질을 모방 복잡한을 만들려면 디자인은 동일하게 일반적으로 이러한 게이 및 이종 dimeric TM 단지와 같은 약한 비 공유 결합 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다 복합체를 안정화 할 수 있도록 설계 이황화 채권을 생성에 적합합니다 표피 성장 인자 수용체는 (EGFR) 가족 단백질 2-4 또는 heterodimeric의 αβ 인테그린 단지 5,6. 같은 지방질에서 파생 된 것과 같은 매우 소수성 펩타이드 시퀀스 이중층 - 스패닝 TM 단백질의 일부​​ 것은 생화학 및 biophysical 연구 대단히 어려운 과목입니다. 표준 단백질과 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하는 것은 매우 어려운 것뿐만 아니라, 그들은 종종 세포에 매우 독성이 있으므로 recombinantly 생산하기가 어렵습니다. 우리 7,8 등 9-11이 가지고에서 프레임 카르복시 - 터미널로 세균 이러한 어려운 펩타이드 시퀀스를 표현 상당한 성공E.에서 파생 된 ΔtrpLE1413 순서의 수정 된 버전 fusions 대장균 TRP 오페론 12. 이 시퀀스로 인코딩 ~ 13 kDa trpLE 폴리펩티드는 T7 프로모터에 따라 높은 수준의 생산 할 수 있으며 완전히 독성 및 / 또는 불안정에 관한 문제가 피할 아르 포함 단체로 지역화되어 있습니다. 아미노 터미널 9 히스티딘 태그 13 trpLE 순서에서 내부 메티오닌과 시스테인 잔류 물을 제거 금속 이온 친화도 크로마토 그래피에 의해 정화되고 소화 할 14 수 trpLE - 펩타이드 fusions는 시안 브로마이드 (CNBr을 사용하는 추가하여 순서의 변경 ) 원하는 펩타이드 시퀀스를 공개합니다. 우리는 성공적으로 많은 사 등의 TM 도메인을 포함 멤브레인 단백질 조각을 대표 trpLE fusions 등의 12 개의 시퀀스 이상을 표현하기 위해이 시스템을 사용하면 (7,8 및 게시되지 않은 결과, 또한 토론 섹션을 참조). 이 프로토콜의 주요 혁신은 구조화 매우 저조한 용해 trpLE-TM fusions 효율적으로 간소화 된 워크 플로우의 맥락에서 이황화 - 가교가 될 수있는 아래의 조건을 식별합니다. 높은 수율 표현, 취급 및 펩타이드 제품의 정화의 여러 측면은 철저하게 최적화하고, 여기에서 제시 한 권고는 비 이황화 - 가교 (monomeric) TM 펩타이드 제품의 생산을위한 동등하게 관련이되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시안 브로마이드 </td><td> 올드리치 </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의해 매우 독성, 피부에 접촉하고있는 경우는 삼켰다. 산과의 접촉은 매우 독성 가스를 liberates. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic 산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P.CODE - 1000984387, CAS 번호 76-05-1 </td><td> 유해 약물. 위험물이 있습니다., 심각한 화상을 일으킨다. 흡입에 의한 유해. 수생 생물에 유해, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P.No M7154, CAS 번호 60-24-2 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한, 피부 접촉 및 삼킨 경우 독성. 피부에 자극. 눈에 심각한 손상의 위험. 피부 접촉에 의해 sensitization의 원인이 될 수 있습니다. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro-2 - 프로 파놀 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 제품 번호 52512, CAS-아냐. 920-66-1 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한 위험하고 경우가 삼켰다. 화상됩니다. </td></tr><tr><td> 개미의 산 </td><td> 머크 KGaA </td><td> K41186564 </td><td> 가연성 액체 및 증기. 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 발생합니다. </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> UNIVAR, AJAX FINECHEM </td><td> 제품 번호, 817, CAS - 아니, 57-13-6 </td><td> 가열, 12 월이산화탄소와 암모니아로 omposes, 구운 경우, 질소 산화물의 작은 양을 방출. 빨갛게 및 피부와 눈의 자극을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 구아니딘 히드로 클로라이드 </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS 번호 : 50-01-1 </td><td> 삼킨 경우 유해한, 심각한 눈 염증을 일으킨다 피부 자극, 급성 독성 구강, 피부 자극, 눈 자극이 발생합니다. </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 </td><td> 제품 번호 - T8532 CAS 번호 : 9002-93-1 </td><td> 트리톤 X-100는 종종 단백질을 solubilize하기 위해 생화학 응용 프로그램에서 사용하는 nonionic 세제, 100 % 활성 성분입니다. 트리톤 X-100는 항균 특성을가 없으며, 비교적 온화한 비 denaturing 세제를 고려 </td></tr><tr><td> 그의 - 선택 니켈 - 선호도 젤 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 카탈로그 개수-P6611 </td><td> IS-선택 니켈 선호도 젤은 고정 금속 이온 친화도 크로마토 그래피 (아이맥) 제품입니다. HIS - 선택 닉엘 선호도 젤은 특별히 히스티딘이 포함 된 단백질에 바인딩하도록 설계되어 니켈 혐의로 기소 구슬 아가로 오스의 독점적 인 quadridentate 킬레이트입니다. </td></tr><tr><td> (-)-글루타티온, 산화 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 카탈로그 NUM 150,568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (단종) </td><td> 최대 전원 출력 600w. 0.5 인치 교체 - 팁 프로브는 0.5 인치 높은 강도, 높은 볼륨 팁과 높은 강도, 낮은 볼륨 팁의 범위를 걸립니다. 이 회사에서 현재 사용할 수있는 가장 가까운 모델은 Q500 및 Q700 있습니다. </td></tr><tr><td> RP-HPLC : 생물학적 DuoFlow 크로마토 그래피 시스템, 소프트웨어 버전 5.3 </td><td> 바이오 RAD 연구소 </td><td> 카탈로그 개수 760-0047, 구성 번호 : AU500571, 시리얼 번호 : 484BR3705 </td><td> 펩티드는 높은 AQ의 위상 HPLC 컬럼을 취소에 바인딩ueous 모바일 위상 및 높은 유기 모바일 위상과 RP HPLC 컬럼에서 용출되어 있습니다. RP에서 HPLC의 펩티드들은 소수성 문자에 따라 구분됩니다. 펩티드는 유기 용매의 선형 그라데이션을 실행하여 분리 할 수​​ 있습니다. </td></tr><tr><td> 준비 HT C3 ZORBAX 300SB-HPLC 분석 칼럼, 21.2 X 150mm, 5 μm의 입자 크기 </td><td> 애질런트 </td><td> 제품 번호 : 895150-909 </td><td> 반대로 상 HPLC 칼럼 </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% 비스 - 트리스 젤 </td><td> 생명 기술 </td><td> NP0341BOX </td><td> 단백질 전기 영동을위한 사전 주조 젤 </td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer G2 투석 카세트, 3.5K MWCO </td><td> 열 과학 </td><td> 제품 번호 : 87724 </td><td> 샘플 투석 </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

막 단백질의 지질 내장 된 알파 - 나선형 도메인 간의 물리적 상호 작용은 막 단백질 단지의 접이식 및 조립과 같은 transmembrane (TM) 신호와 세포 표면 단백질 수준의 조절, 동적 인 프로세스에서 매우 중요한 역할을한다. 특정 시퀀스의 연결을 운전 구조적 기능을 이해하는 것은 TM의 펩타이드 단지의 정교한 biophysical 및 생화학 분석이 필요합니다. 그러나, TM 도메인의 극단적 인 소수성는 표준 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하도록 매우 어렵게 만듭니다, 그리고 적절한 학습 자료의 생산은 종종 prohibitively 도전 증명한다. 펩티드는 현재 안정적으로 나선형 conformations 및 양식 단지를 채택 할 수있는 환경을 확인하는 것은 자발적으로 어려움의 추가 수준을 추가합니다. 여기 E.하에 게이 또는 자료에서 이종 dimeric TM의 펩타이드 단지의 생산을위한 절차를 제시 안부난, 따라서 핵 자기 공명에 대한 안정적인 동위 원소 라벨 (NMR) 또는 상대적으로 저렴하게 다른 응용 프로그램이 아닌 천연 아미노산의 설립을 허용. 이 방법의 주요 혁신은 TM 단지는 생산 및 세제, 지질 또는 기타 막 모방 재료로 재구성 할 때 안정적인 화학 양 론적하고 균일 한 구조를 형성 할 수 covalently 관련 (이황화-가교) 어셈블리로 정화된다는 것입니다. 우리는 하나의 TM 도메인 또는 가교 단지를 생산 여부 동등하게 적용하고 새로운 TM 시퀀스에이 방법을 조절하기위한 조언을 제공 표현과 정화에 대한 조심스럽게 최적화 된 절차를 제시한다.

trpLE fusions에 달성 표현의 수준은 변수 첨부 된 펩타이드의 아미노 산 순서에 크게 의존한다. 그림 3은 사전 유도의 SDS-PAGE 분석 (차선 1) 시간의 수확 (차선 2) 표시 문화 1 리터과 4 ML의 니켈 매트릭스에서 순수한 그대로 trpLE-DAP12TM 융합의 약 12​​0 밀리그램이 나왔고 문화에서 샘플. trpLE - DAP12TM 융합의 모든으로 표면에 뜨는 (레인 3)에 반대 포함 몸 펠릿 (레인 4)로 번역되었습니다. ...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

단일 분자의 단백질 연구에 대한 표면 패시베이션

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

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