Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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O financiamento para esta obra é fornecida pelo National Health and Medical Research Council da Austrália (NHMRC projeto de subsídio para 1.011.352 MEC e MJC; institutos de pesquisa independentes Regime de Apoio Infra-estrutura [IRIISS] subvenção para WEHI) e do Governo de Victoria (VESKI Inovação Fellowship ao MEC; vitoriana do Governo do Estado de Infra-estrutura de Apoio Operacional à WEHI). MEC é uma rainha Elizabeth II Fellow do Conselho de Pesquisa Australiano. EFXB reconhece o apoio do Programa de Bolsas de Norma Hilda Schuster, da Universidade de Melbourne.

1. Clonagem e Design Construct Clonar as sequências de interesse no vector PMM-peptídeo (que podem ser fornecidos a pedido), utilizando os locais de restrição HindIII e BamHI (ver Figura 1). O inserto de DNA de cadeia dupla deve incorporar, na seguinte ordem: um sítio HindIII, um único codão de metionina para a clivagem com CNBr, a E. peptídeo coli codões optimizados sequência codificadora, um codão de paragem, um sítio BamHI. Todas as outras meti...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. 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A expressão de fusões trpLE-TM. Na nossa experiência, trpLE-TM fusões são pobremente expressa em meio de cultura rico, a 37 ° C, e as condições de cultura aqui descritas tenham sido bem sucedida para muitas sequências diferentes contendo 1-4 domínios TM com rendimentos variando 50-150 mg / L de fusão pura e intacta. Codificação de fusões de três ou de quatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 e TM4-TM7, respectivamente) ou um fragmento do núcleo catalítico da peptidase sinal peptídeo h...

Este protocolo detalhes um procedimento que desenvolvemos para produzir complexos estabilizados por dissulfureto de transmembrana (TM) péptidos para estudos estruturais de RMN utilizando solução. O processo tira partido da expressão robusta proporcionada pelo sistema de fusão ΔtrpLE1413 (ver abaixo) e permite que os complexos de peptídeos de TM da composição definida para ser gerados usando técnicas sofisticadas de isótopos estáveis ​​de rotulagem para as modernas experiências de RMN multidimensionais. Nós empregamos essas técnicas para determinar as estruturas de RMN, que revelou várias novas e importantes informações sobre como linfócitos activadores immunoreceptors são montados a partir de subunidades de proteínas de membrana múltiplas através de interacções entre os seus domínios TM (recentemente revisto em 1). Estas técnicas são aplicáveis ​​a muitos outros sistemas de membrana de proteína, bem como uma grande variedade de métodos analíticos a jusante para além RMN solução. Enquanto o exemplo dado aqui utiliza resíduos de cisteína nativospara criar um complexo que imita o naturalmente ligado por dissulfureto da proteína, a concepção é igualmente adequado para a criação de pontes de dissulfureto para estabilizar complexos de engenharia que são normalmente mantidas juntas por mais fracas, de interacções não covalentes tais como homo-e hetero-dímeros de complexos TM receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) da família de proteínas ou complexos de 2-4 heterodiméricos αβ integrina 5,6. Extremamente hidrofóbicos sequências de péptidos tais como os derivados a partir da bicamada lipídica que mede porções de proteínas TM são assuntos extremamente difíceis para estudos bioquímicos e biofísicos. Para além de ser muito difícil de manipular utilizando proteína padrão e técnicas de química de péptidos, são frequentemente muito tóxicos para as células e, portanto, são difíceis de produzir por via recombinante. Nós e outros 7,8 9-11 têm tido um sucesso significativo expressar tais sequências peptídicas difíceis em bactérias tal como no quadro-carboxi-terminalfusões com uma versão modificada da sequência ΔtrpLE1413 derivado da E. coli operão trp 12. O polipéptido ~ 13 kDa trpLE codificada por esta sequência pode ser produzido em níveis elevados no âmbito de um promotor T7 e é totalmente localizado para corpos de inclusão em que os problemas relacionados com a toxicidade e / ou de instabilidade são contornadas. Modificação da sequência, por adição de um ácido amino-terminal 9 de histidina-tag 13 e eliminação de resíduos internos de metionina e cisteína da sequência de 14 trpLE permitidos trpLE peptídicos fusões de ser purificadas por cromatografia de afinidade de metal-ião e digerido com brometo de cianogénio (CNBr ) para libertar a sequência peptídica desejada. Temos utilizado com sucesso este sistema para expressar mais de uma dúzia de diferentes seqüências como fusões trpLE representam fragmentos de proteínas de membrana que contêm até quatro domínios TM (7,8 e resultados inéditos, ver também seção de discussão). Oinovação chave neste protocolo é a identificação das condições em que os não estruturados e muito pouco solúvel trpLE-TM fusões podem ser eficientemente dissulfureto reticulado no contexto de um fluxo de trabalho simplificado. Vários aspectos da expressão de elevado rendimento, manipulação e purificação de produtos peptídicos foram também cuidadosamente optimizadas, e as recomendações aqui apresentadas são igualmente relevantes para a produção de não-reticuladas de dissulfureto (monomérico) Produtos TM peptídicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Brometo de cianogénio </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> Substância perigosa. Mercadorias perigosas. Muito tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. O contato com ácidos liberta gases muito tóxicos. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático. </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, número CAS 76-05-1 </td><td> Substância perigosa. Mercadorias perigosas., Provoca queimaduras graves. Nocivo por inalação. Nocivo para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no ambiente aquático. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, número CAS 60-24-2 </td><td> Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Irritante para a pele. Risco de lesões oculares graves. Pode causar sensibilização em contacto com a pele. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Número do produto 52512, CAS. 920-66-1 </td><td> Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Nocivo por inalação e ingestão. Causa queimaduras. </td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Líquido inflamável e vapor. Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Número de Produto, 817, CAS 57-13-6 </td><td> Quando aquecido, dezembroomposes de dióxido de carbono e amónia; se queimado, emite pequenas quantidades de óxidos de azoto. Pode causar vermelhidão e irritação da pele e dos olhos. </td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Número CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo se ingerido, causa irritação ocular grave, provoca irritação da pele, toxicidade oral aguda, irritante da pele Irritante aos olhos. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Número-T8532 produto CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 é um detergente não iónico, 100% do ingrediente activo, que é muitas vezes utilizado em aplicações bioquímicas para solubilizar as proteínas. Triton X-100 não tem propriedades antimicrobianas e considerado como um detergente comparativamente suave não desnaturante </td></tr><tr><td> Sua-Select gel níquel-Affinity </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catálogo Num-P6611 </td><td> IS-Select Gel de Afinidade O níquel é um produto de metal imobilizado iões de cromatografia de afinidade (IMAC). O Nick HIS-Selectel gel de afinidade é um quelato de propriedade quadridentado em agarose frisado carregada com níquel, que é concebido para ligar especificamente proteínas contendo histidina. </td></tr><tr><td> (-)-Glutationa, oxidado </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Num catálogo 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix sonicador S-3000 </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (descontinuado) </td><td> Potência máxima de 600 watts. Ponta da sonda substituível 1,2 cm leva 1,2 cm de alta intensidade, alto volume de dicas e uma gama de alta intensidade, baixo volume dicas. Mais próximos modelos atualmente disponíveis nesta empresa são Q500 e Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: BioLogic sistema de cromatografia DuoFlow, versão de software 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Num catálogo 760-0047, Config Não: AU500571, No de série: 484BR3705 </td><td> Liga-se a péptidos de colunas de fase reversa de HPLC em alta aqfase móvel ueous e são eluídos de colunas de RP HPLC com fase orgânica elevada móvel. Em RP HPLC péptidos são separados com base no seu carácter hidrófobo. Os péptidos podem ser separados através da execução de um gradiente linear de solvente orgânico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-coluna analítica de HPLC, de 21,2 x 150 mm, tamanho de partícula 5 | iM </td><td> Agilent </td><td> Não Produto: 895150-909 </td><td> HPLC em fase reversa colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gels </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Pré géis elenco para eletroforese de proteínas </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Cassetes diálise, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nenhum produto: 87724 </td><td> Amostra de diálise </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interacções físicas entre os lípidos incorporados alfa-helicoidais domínios de proteínas da membrana desempenham um papel crucial na dobragem e montagem de complexos de proteínas de membrana e em processos dinâmicos, como transmembranar (TM) de sinalização e regulação dos níveis de proteína da superfície celular. Compreender as características estruturais de condução a associação de seqüências particulares requer sofisticadas análises biofísicos e bioquímicos de complexos peptídeo TM. No entanto, a hidrofobicidade extrema de domínios TM torna-os muito difíceis de manipular utilizando técnicas de química de péptidos e a produção de material de estudo adequado muitas vezes se torna proibitivamente desafiador. Identificando as condições sob as quais os péptidos podem adoptar conformações helicoidais estáveis ​​e formam complexos espontaneamente acrescenta outro nível de dificuldade. Apresentamos aqui um processo para a produção de homo-ou hetero-dímeros de complexos de peptídeos de TM a partir de materiais que são expressas em E. coli, o que permite a incorporação de etiquetas de isótopos estáveis ​​para a ressonância magnética nuclear (RMN), ou não naturais, ácidos aminados para outras aplicações de forma relativamente barata. A principal inovação neste método é que os complexos de TM são produzidos e purificados como covalentemente associadas (dissulfureto reticulado) montagens que podem formar estruturas estáveis, estequiométrica e homogéneo, quando reconstituído em lípido detergente, ou outros materiais de membrana-miméticos. Nós também apresentamos procedimentos cuidadosamente otimizados para expressão e purificação que são igualmente aplicáveis ​​se produzir domínios únicos TM ou complexos reticulados e dar conselhos para adaptar estes métodos para novas seqüências TM.

O nível de expressão obtido para fusões trpLE é variável e fortemente dependente da sequência de amino-ácido do péptido ligado. Figura 3 mostra a análise de SDS-PAGE de pré-indução (pista 1) e de tempo de colheita (pista 2) As amostras de uma cultura que produziu aproximadamente 120 mg de puro, fusão trpLE-DAP12TM intacta a partir de 1 litro de cultura e de 4 ml de matriz de níquel. Toda a fusão trpLE-DAP12TM foi localizado para a inserção do corpo de pelotas (pista 4), em oposição ao...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

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