Name: production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00
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La financiación de este trabajo es proporcionada por el Sistema Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (NHMRC subvención del proyecto 1011352 al MEC y MJC, Institutos de Investigación Independiente Plan de Apoyo a la Infraestructura [IRIISS] subvención a WEHI) y el Gobierno de Victoria (Veski Innovación Becas MEC a; Apoyo del Gobierno del Estado de Victoria Operacional Infraestructura para WEHI). MEC es una reina Elizabeth II Fellow del Consejo de Investigación Australiano. EFXB reconoce el apoyo del Programa de Becas Norma Hilda Schuster de la Universidad de Melbourne.

1. Clonación y Diseño Construct Clonar las secuencias de interés en el vector de PMM-péptido (que se puede proporcionar a petición) usando HindIII y sitios de restricción BamHI (véase la Figura 1). El inserto de ADN de doble hebra deben incorporar, en el orden siguiente: un sitio HindIII; un solo codón metionina para la escisión con CNBr, la E. coli codón optimizado péptido secuencia de codificación, un codón de parada, un sitio BamHI. Todas las metionina...

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. 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Expresión de trpLE-TM fusiones. En nuestra experiencia, trpLE-TM fusiones se expresó mal en medio de cultivo rico a 37 ° C, y las condiciones de cultivo descritas aquí han demostrado tener éxito para muchas secuencias diferentes que contienen de uno a cuatro dominios TM con rendimientos que oscilan 50 a 150 mg / L de fusión puro, intacto. Codificación de fusiones de tres o cuatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 y TM4 TM7-, respectivamente) o un fragmento de núcleo catalítico de la peptidasa ...

Este protocolo detalla un procedimiento que hemos desarrollado para producir complejos estabilizados con disulfuro de péptidos transmembrana (TM) para los estudios estructurales mediante RMN solución. El procedimiento tiene la ventaja de la expresión robusta que ofrece el sistema de fusión ΔtrpLE1413 (ver más abajo) y permite que los complejos de péptidos de TM composición definida para ser generados usando sofisticadas técnicas de isótopos estables de etiquetado para los modernos experimentos de RMN multidimensionales. Hemos empleado estas técnicas para determinar varias estructuras de RMN que revelaron nueva información importante sobre cómo linfocitos activadores de immunoreceptors se ensambla a partir de múltiples subunidades de proteínas de membrana a través de interacciones entre sus dominios TM (recientemente revisado en 1). Estas técnicas son aplicables a muchos otros sistemas de proteínas de membrana, así como una amplia gama de métodos de análisis aguas abajo, además de RMN solución. Mientras que el ejemplo dado aquí utiliza residuos de cisteína nativospara crear un complejo que imita la forma natural unido por puentes disulfuro de proteínas, el diseño es igualmente adecuado para la creación de enlaces disulfuro de ingeniería para estabilizar complejos que normalmente se mantienen juntas por más débiles, interacciones no covalentes, tales como homo-y hetero-dímeros de complejos TM receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR)-proteínas de la familia 2-4 o αβ heterodimeric complejos integrina 5,6. Extremadamente hidrófobos secuencias de péptidos tales como los derivados de la bicapa lipídica que abarca porciones de proteínas TM son sujetos excesivamente difícil para los estudios bioquímicos y biofísicos. Además de ser muy difícil de manipular usando proteína estándar y técnicas de química de péptidos, a menudo son muy tóxicos para las células y son por lo tanto difíciles de producir recombinantemente. Nosotros y otros 7,8 9-11 han tenido un éxito significativo expresar esas secuencias de péptidos difíciles en bacterias como en marco carboxi-terminalfusiones con una versión modificada de la secuencia ΔtrpLE1413 derivado de la E. coli trp operón 12. El polipéptido de ~ 13 kDa trpLE codificada por esta secuencia se puede producir en niveles elevados en virtud de un promotor T7 y está totalmente localizada en los cuerpos de inclusión donde los problemas relacionados con la toxicidad y / o la inestabilidad son eludidas. Modificación de la secuencia de la adición de un amino-terminal 9-histidina 13 y la eliminación de los residuos internos de metionina y cisteína de la secuencia trpLE 14 permitidos trpLE-péptido fusiones de ser purificada por metal-ion cromatografía de afinidad y digerido usando bromuro de cianógeno (CNBr ) para liberar la secuencia peptídica deseada. Hemos utilizado con éxito este sistema para expresar más de una docena de diferentes secuencias como fusiones TrpLE que representan fragmentos de proteínas de membrana que contienen hasta cuatro dominios TM (7,8 y resultados no publicados, véase también el apartado de discusión). Lainnovación clave en este protocolo es la identificación de las condiciones en las que los no estructurados y muy poco soluble en trpLE-TM fusiones pueden ser eficientemente disulfuro de reticulado en el contexto de un flujo de trabajo optimizado. Varios aspectos de alto rendimiento de expresión, la manipulación y la purificación de los productos peptídicos también se han optimizado a fondo, y las recomendaciones que aquí se presentan son igualmente relevantes para la producción de no reticulados disulfuro productos (monomérica) TM peptídicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromuro de cianógeno </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. Mercancías peligrosas. Muy tóxico por inhalación, contacto con la piel e ingestión. El contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> CP-1000984387, CAS 76-05-1 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. MERCANCÍAS PELIGROSAS., Provoca quemaduras graves. Nocivo por inhalación. Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, Número CAS 60-24-2 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. MERCANCÍAS PELIGROSAS. Tóxico por inhalación, contacto con la piel y por ingestión. Irrita la piel. Riesgo de lesiones oculares graves. Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Número de producto 52512, CAS-No. 920-66-1 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. MERCANCÍAS PELIGROSAS. Nocivo por inhalación y por ingestión. Provoca quemaduras. </td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Líquidos y vapores inflamables. Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares. </td></tr><tr><td> Urea </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Número de producto, 817, N º CAS 57-13-6 </td><td> Cuando se calienta, diciembreomposes a dióxido de carbono y amoníaco, si se quema, emite pequeñas cantidades de óxidos de nitrógeno. Puede causar enrojecimiento e irritación de la piel y los ojos. </td></tr><tr><td> Hidrocloruro de guanidina </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Número CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo si se ingiere, causa irritación ocular grave, Provoca irritación cutánea, toxicidad oral aguda, Irritante de piel, Irritante de ojos. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Number-T8532 Producto CAS No: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 es un detergente no iónico, 100% de ingrediente activo, que se utiliza a menudo en aplicaciones bioquímicas para solubilizar las proteínas. Triton X-100 no tiene propiedades antimicrobianas y es considerado un comparativamente suave no desnaturalizante detergente </td></tr><tr><td> Su-Select níquel-Affinity gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catálogo Num-P6611 </td><td> ES-Select gel de afinidad de níquel es un metal inmovilizado de iones de cromatografía de afinidad (IMAC) del producto. El Nick SU-Selectel gel de afinidad es un quelato patentado quadridentate en perlas de agarosa cargada con níquel que está diseñado para unirse específicamente a las proteínas que contienen histidina. </td></tr><tr><td> (-)-Glutatión, oxidado </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catálogo num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicador </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (descatalogados) </td><td> Potencia máxima de salida de 600 vatios. 1/2-inch reemplazables punta de la sonda se 1/2-pulgada de alta intensidad y consejos de gran volumen y una gama de alta intensidad y bajo volumen de consejos. Más próximos modelos actualmente disponibles de esta empresa son Q500 y Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: doble paso BioLogic sistema de cromatografía, Software Versión 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catálogo Num 760-0047, Config No: AU500571, n º serie: 484BR3705 </td><td> Los péptidos se une a la fase inversa HPLC en columnas de alta aqueous fase móvil y se eluyen de columnas de HPLC RP con alta fase móvil orgánica. En RP HPLC péptidos se separan en base a su carácter hidrófobo. Los péptidos pueden separarse mediante la ejecución de un gradiente lineal de disolvente orgánico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-HPLC analítica columna, 21,2 x 150 mm, tamaño de partícula 5 micras </td><td> Agilent </td><td> No Producto: 895150-909 </td><td> HPLC de fase inversa Colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris geles </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Geles prefabricados para la electroforesis de proteínas </td></tr><tr><td> Slide-A-G2 Lyzer Cassettes diálisis, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> No Producto: 87724 </td><td> Ejemplo de diálisis </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interacciones físicas entre las incrustados lípido-alfa-helicoidales dominios de proteínas de membrana juegan un papel crucial en el plegamiento y ensamblaje de los complejos de proteínas de membrana y en procesos dinámicos tales como transmembrana (TM) de señalización y regulación de los niveles de proteína de la superficie celular. Descripción de las características estructurales que impulsan la asociación de secuencias particulares requiere sofisticados análisis biofísicos y bioquímicos de los complejos de péptido de TM. Sin embargo, la hidrofobia extrema de dominios TM hace que sean muy difíciles de manipular utilizando técnicas estándar de la química de péptidos, y la producción de material de estudio adecuado a menudo resulta prohibitivamente difícil. La identificación de condiciones bajo las cuales los péptidos pueden adoptar conformaciones helicoidales estables y complejos se forman espontáneamente añade un nivel más de dificultad. Aquí presentamos un procedimiento para la producción de homo-o hetero-dímeros complejos de péptido de TM a partir de materiales que se expresan en E. columnai, permitiendo así la incorporación de etiquetas de isótopos estables para resonancia magnética nuclear (RMN) o no naturales de aminoácidos para otras aplicaciones relativamente económica. La innovación clave de este método es que los complejos de TM son producidos y purificados como covalentemente asociados (disulfuro de reticulado) ensamblados que pueden formar estructuras estables, estequiométrica y homogénea, cuando se reconstituye en detergente, lípidos u otros materiales miméticos de membrana. También presentamos los procedimientos cuidadosamente optimizados para la expresión y purificación que son igualmente aplicables ya sea para producir un solo TM dominios o complejos entrecruzados y proporcionar asesoramiento para adaptar estos métodos a las nuevas secuencias de TM.

El nivel de expresión logrado en las fusiones TrpLE es variable y depende en gran medida de la secuencia de aminoácidos del péptido adjunto. Figura 3 muestra el análisis SDS-PAGE de pre-inducción (pista 1) y tiempo de cosecha-(carril 2) muestras de una cultura que produjo aproximadamente 120 mg de pura e intacta trpLE-DAP12TM fusión de 1 litro de cultivo y 4 ml matriz de níquel. Todos los de la fusión trpLE-DAP12TM fue localizado en el cuerpo de inclusión de precipitado (carril 4) en lugar de s...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

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