Name: in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a L. Belluscio para equipamentos de cirurgia filmagens, D. Kwon para filmar assistência, K. Liu para edição de vídeo, assistência e K. MacLeod para toda a música de fundo. KW reconhece o generoso apoio da Divisão de Programas de Pesquisa NIMH intramurais e os genes, Cognição e do Programa de Psicose. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Pesquisa NIMH intramuros (VC, YY, SMKW) e da Divisão de Programa de Pesquisa NIAAA intramuros clínica e biológica (VC, RMC, DML).

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Instituto Nacional de Atenção à Saúde Mental Animal e Comitê de Uso e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparação pré-operatória <ol><li> Limpe todas as ferramentas em um esterilizador quente talão antes da cirurgia asséptica, limpar o local da cirurgia com etanol 70%, e colocou panos limpos. Usar luvas estéreis. Anestesiar...

<ol>
	<li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity.">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li><li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system.">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li><li>Guzowski, J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

O método de imagem in vivo descrito aqui permite o exame repetido de mudanças Arco de expressão de genes nos mesmos conjuntos de neurônios durante vários dias no animal vivo. É um método eficiente e versátil para a obtenção de informação sobre a plasticidade neural relacionadas com a dinâmica molecular em neurónios individuais em resposta a várias experiências comportamentais. Padrão métodos histoquímicos como a hibridização in situ e imuno pode conseguir uma única célula resolu?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotão microscópio de varredura a laser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Stereotaxis fase cirurgia para ratos </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> 20X 25X ou objetiva de imersão de água </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Estágio do microscópio com cabeça de fixação de quadro </td><td> Feitos </td><td> N / A </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Pinça fina </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Dental broca rebarba </td><td> Belas Science Tools </td><td> 19007-05 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 bits </td><td> Imagem </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

A capacidade do cérebro de mudar em resposta a experiência é essencial para a função saudável do cérebro, e anomalias no presente processo contribuem para uma variedade de desordens cerebrais 1,2. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais os circuitos cerebrais reagem a experiência de um animal requer a capacidade de monitorar as alterações dependentes da experiência molecular em um dado conjunto de neurónios, ao longo de um período de tempo prolongado, em que o animal vivo. Embora a experiência e atividade neural associada é conhecido por desencadear mudanças de expressão gênica em neurônios 1,2, a maioria dos métodos para detectar tais mudanças não permitir a observação repetida dos mesmos neurônios durante vários dias ou não tem resolução suficiente para observar neurônios individuais 3 , 4. Aqui, descrevemos um método que combina in vivo de dois fótons de microscopia, com um repórter fluorescente geneticamente codificado para rastrear experiência dependentes de mudanças de expressão gênica em neurônios corticais individuais sobre o<html> claro do dia-a-dia experiência. Uma das bem estabelecidas experiência dependentes de genes é regulada Atividade proteína associada citoesqueleto (Arco) 5,6. A transcrição do arco é rápida e altamente induzida pela intensificação da actividade neuronal 3, e do seu produto de proteína regula a endocitose de receptores de glutamato e de longo prazo de plasticidade sináptica 7. A expressão do arco tem sido amplamente utilizada como um marcador molecular para mapear os circuitos neuronais envolvidas em comportamentos específicos 3. Na maioria destes estudos, a expressão Arc foi detectada por hibridação in situ ou imuno-histoquímica em secções de cérebro fixos. Embora esses métodos revelaram que a expressão do arco foi localizada para um subconjunto de neurónios excitatórios após experiências comportamentais, como os padrões de expressão celular do arco pode mudar com múltiplos episódios de experiências repetidas ou distintivo mais dias não foi investigada. ntent &quot;&gt; in vivo de dois fótons de microscopia oferece uma poderosa forma de examinar a experiência adquirida dependentes de alterações celulares no cérebro vivo 8,9. Para permitir a análise de expressão Arc em neurônios vivos por dois fótons de microscopia, que anteriormente gerou um knock- na linha de rato em que um repórter GFP é colocado sob o controle do promotor endógeno do arco 10. Este protocolo descreve as preparações cirúrgicas e procedimentos de imagiologia de seguimento experiência dependentes de padrões de expressão de Arc-GFP em conjuntos neuronais do animal vivo. Neste método , crónicas janelas cranianas foram primeiro implantado em ratinhos Arc-GFP nas regiões corticais de interesse. Estes animais foram então repetidamente fotografada por dois fotões microscopia após desejados paradigmas de comportamento ao longo de vários dias. Este método pode ser geralmente aplicável a animais portadores outros repórteres fluorescentes de experiência dependentes de alterações moleculares 4.

<html> Este protocolo descreve um método para rastrear experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios corticais individuais em animais vivos. Uma janela crónica craniana é primeiro criado sobre uma região cortical de interesse num rato carregando um repórter fluorescente da expressão do gene. Dois fotão-microscopia pode então ser acoplado com vários paradigmas de comportamento para observar comportamentalmente induzidas alterações moleculares em neurónios individuais e rastrear tais mudan...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais. Um<em&gt; In vivo</em&gt; Dois fótons método de imagem é descrito aqui que permite o acompanhamento de tais alterações moleculares em individuais neurônios corticais através de repórteres codificados geneticamente.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

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A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Neurociência

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

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Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

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Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

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Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

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Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

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Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

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In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

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Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

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Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

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