Name: labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00
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Nous avons utilisé deux variantes légèrement différentes de la méthode de marquage seul neurone dans nos laboratoires. Les différences portent sur ​​la collecte d&#39;embryons, dechorionisation, devitellinisation et les étapes de filetage embryons. Figure 1 donne un aperçu des étapes communs et divergents des variantes. 1. Préparation des micro-aiguilles pour dissection de l&#39;embryon et Micropipettes pour injection Dye <ol><li> Aiguilles de verre pour la d...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+growth+cone+to+synapse:+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron.">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures.">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li><li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages.">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing.">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+tungsten+microelectrode.">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li><li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations.">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li><li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics,+filopodial+length,+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile.">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li><li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS:+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron.">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li><li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+grasshopper+to+Drosophila:+a+common+plan+for+neuronal+development.">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li><li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect,+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata.">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li><li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation,+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede,+Ethmostigmus+rubripes+(Brandt).">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li><li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo:+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery.">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li><li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods:+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans.">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li><li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila.">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li></ol>

Un avantage majeur de la drosophile comme modèle de système est qu&#39;il permet l&#39;analyse du développement et de la fonction au niveau des cellules individuelles. Ceci est particulièrement utile en ce qui concerne le système nerveux, où la diversité des types de cellules est exceptionnellement élevé et la fonction et la morphologie des cellules voisines peut être totalement différente. Procédé nous présentons ici permet le marquage des neurones individuels avec un...

La connaissance de la morphologie neuronale au niveau des cellules individuelles est une condition essentielle pour la compréhension de la connectivité neuronale et la fonction du système nerveux central. Ainsi, dès les premiers jours de la neuroscience, les chercheurs ont cherché à développer des simples techniques de marquage de cellules (voir 7 pour un traitement historique de cette question). Les méthodes classiques comme la coloration de Golgi fournir une excellente résolution de la morphologie neuronale, mais ne sont pas adaptés si l&#39;on cherche à identifier un type particulier de neurone d&#39;une manière dirigée, que la coloration se produit de façon aléatoire. Le développement de méthodes pour la coloration des cellules individuelles par injection intracellulaire ou juxtacellulaire de colorants à partir d&#39;une microélectrode l&#39;exigence en matière d&#39;étiquetage spécifique. L&#39;application de neurone unique colorant injection chez la drosophile a présenté un défi majeur, en raison de la petite taille de l&#39;organisme et à la fois ses neurones. Néanmoins, la coloration seul neurone de Drosophila embryonnaire </em&gt; Neurones a été atteint au milieu des années 1980 dans le laboratoire de Corey Goodman 15. Bien que la méthode a été éminemment utile et a fourni des renseignements clés sur les mécanismes de développement neuronal chez la drosophile au cours des 20-30 dernières années (par exemple, 2, 10), de nombreux travailleurs ont renoncé en grande partie à cause de ses exigences techniques. La disponibilité de ces dernières années des techniques génétiques pour l&#39;étiquetage des neurones chez la drosophile a également contribué à l&#39;impopularité de l&#39;injection de colorant unique neurone. Expression GAL4-dirigé des constructions GFP membrane ciblées peuvent fournir une excellente résolution de la morphologie des neurones 1, 20. Cependant, cette méthode présente certaines limites: l&#39;expression souvent inévitable de la GFP dans les cellules multiples peuvent obscurcir la structure des neurones individuels et une ligne pilote de GAL4 peut ne pas être disponible pour conduire l&#39;expression dans un neurone d&#39;intérêt particulier. Le MarcM (Analyse mosaïque avec un représentantmarqueur des cellules ressible) Méthode 8 peut fournir l&#39;étiquetage des neurones essentiellement tout au niveau de la cellule individuelle, mais ne peut pas être utilisé avec succès dans l&#39;embryon et la larve au début à cause de la rotation lente de la protéine GAL80. Compte tenu de ces limites de l&#39;étiquetage génétique, nous croyons que l&#39;injection de colorant seul neurone dans l&#39;embryon de drosophile reste une technique intéressante et mérite une plus large application. Pour promouvoir cet objectif, nous proposons ici une description détaillée de la méthode. Une illustration de sa puissance est fournie par notre récent compte de la morphologie de l&#39;ensemble des interneurones dans neuromeres abdominale de l&#39;embryon chez la drosophile fin 14. Cette étude, qui révèle à la fois la variabilité morphologique des différents types de cellules neuronales et les principes d&#39;organisation neuromere dans le SNC de l&#39;embryon, n&#39;aurait pas été possible avec n&#39;importe quelle méthode d&#39;étiquetage actuellement disponible autres.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIFS </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml dans 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Dil </td><td> Sondes Invitrogen / moléculaires </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml dans de l&#39;éthanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldéhyde</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% dans du PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glycérol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% dans du PBS </td></tr><tr><td> Heptane colle </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Violoncelle 31-39-30 * </td><td> diluer env. 1 à 1 avec du n-heptane </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> de visualiser et de documenter les marquages ​​en fluorescence </td></tr><tr><td> DC - unemplifier </td><td> Dragan Corporation </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> pour effectuer les marquages </td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> de préparer et de disect embryons </td></tr><tr><td> Plat capillaires </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> le diamètre extérieur de 1 mm, épaisseur 0,1 mm verre </td></tr><tr><td> Injection capillaires </td><td> Science Products </td><td> 100 Go TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> R micromanipulateur </td><td> Leica </td><td></td><td> pour effectuer les marquages </td></tr><tr><td> Modèle P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> de tirer capillaires </td></tr><tr><td> Diapositives Objets </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld supérieure</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope scientifique </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> pour voir les marquages ​​après photoconversion </td></tr><tr><td> Microscope scientifique </td><td> Olympe </td><td> BX50 </td><td> pour effectuer les marquages </td></tr><tr><td> Caméra vidéo Sony MC3255 </td><td> Sony / AVT Corne </td><td> Sony MC3255 </td><td> pour enregistrer marquages ​​après photoconversion </td></tr></tbody></table> Tableau 1.

labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster

Dans cet article, nous décrivons comment étiqueter individuellement les neurones dans le SNC embryonnaire de Drosophila melanogaster par injection juxtacellulaire de la membrane lipophile Dil marqueur fluorescent. Cette méthode permet la visualisation de la morphologie des cellules neuronales dans les moindres détails. Il est possible de marquer n&#39;importe quelle cellule du système nerveux central: les corps cellulaires des neurones cibles sont visualisés sous une optique DIC ou par expression d&#39;un marqueur fluorescent génétique comme la GFP. Après marquage, le DiI peut être transformée en une tache brune permanente par photoconversion pour permettre la visualisation de la morphologie des cellules avec de la lumière transmise et de l&#39;optique DIC. Alternativement, les cellules Dil-marqués peuvent être observés directement par microscopie confocale, permettant génétiquement introduits protéines rapporteurs fluorescents à colocalised. Cette technique peut être utilisée dans n&#39;importe quel animal, quelle que soit le génotype, ce qui permet d&#39;analyser les phénotypes mutants à résolution cellule unique.

La figure 4 illustre les résultats typiques de la technique, que nous décrivons ici. Figure 4A montre un exemple de Dil interneurone unique rempli qui a été proprement photoconverted. Il démontre bien le niveau de détail de ces préparatifs offre. Lorsqu&#39;elle est vue sous une optique DIC le contexte spatial de la cellule marquée dans le tissu environnant non marqué est visible, par exemple, la position du corps de la cellule à l&#39;intérieur de l&#39;écorce et d...

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Nous présentons une technique pour l&#39;étiquetage des neurones simples dans le système nerveux central (SNC) de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons, ce qui permet l&#39;analyse de la morphologie neuronale soit par lumière transmise ou microscopie confocale.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

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