Name: labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מDFG לGMT

אנחנו השתמשנו בשתי גרסות שונות מעט של שיטת תיוג נוירון הבודדה במעבדות שלנו. ההבדלים מתייחסים לאוסף העובר, dechorionisation, devitellinisation וצעדי המגואלת בדם עובר. איור 1 נותן סקירה של השלבים הנפוצים והמתפצלים של הגרסות. 1. הכנת מייקרו מ...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+growth+cone+to+synapse:+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron.">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures.">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li><li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages.">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing.">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+tungsten+microelectrode.">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li><li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations.">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li><li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics,+filopodial+length,+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile.">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li><li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS:+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron.">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li><li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+grasshopper+to+Drosophila:+a+common+plan+for+neuronal+development.">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li><li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect,+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata.">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li><li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation,+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede,+Ethmostigmus+rubripes+(Brandt).">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li><li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo:+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery.">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li><li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods:+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans.">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li><li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila.">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li></ol>

אחד יתרונות עיקריים של דרוזופילה כמודל למערכת הוא שהיא מאפשרת ניתוח של התפתחות ותפקוד ברמה של תאים בודדים. זה שימושי במיוחד לגבי מערכת עצבים, שם המגוון של סוגי תאים הוא גבוה במיוחד והתפקוד והמורפולוגיה של תאי שכנים יכולים להיות שונים לחלוטין. <p class="jove_content" style=...

ידע של מורפולוגיה עצבית ברמה של תאים בודדים הוא תנאי מפתח להבנת קישוריות עצבית ותפקוד מערכת עצבים מרכזיים. כך, החל מהימים הראשונים של מדעי המוח, החוקרים בקשו לפתח טכניקות תיוג תא בודדות (ראה 7 לטיפול הסטורי של בעיה זו). שיטות קלסיות כגון צביעת Golgi לספק רזולוציה מצוינת של מורפולוגיה עצבית אך אינן מתאימים אם אחד מבקש לתייג סוג מסוים של נוירון באופן מכוון, כמכתים מתרחשת באופן אקראי. הפיתוח של שיטות להכתמת תאים בודדים על ידי הזרקה תאית או juxtacellular של צבעים מmicroelectrode התייחס לדרישה של תיוג ספציפי. היישום של זריקה אחת נוירון לצבוע כדי תסיסנית הציג אתגר גדול, בגלל גודלו הקטן של שניהם האורגניזם ותאי העצב שלה. עם זאת, כתמי נוירון בודדים של עוברית דרוזופילה </emהנוירונים&gt; הושגו באמצע 1980 במעבדה של הקורים 15 גודמן. בעוד השיטה הייתה בהחלט שימושית וספקה כמה תובנה חשובות על מנגנונים להתפתחות עצבית בדרוזופילה במשך 20-30 השנים האחרונות (לדוגמה, 2, 10), עובדים רבים נרתעו ממנו, בעיקר בגלל הדרישות הטכניות שלה. הזמינה בשנים האחרונות יותר של טכניקות גנטיות לתיוג עצבי בדרוזופילה גם תרם לפופולריות של הזרקת צבע נוירון בודדה. ביטוי GAL4 ביים של מבני GFP קרום ממוקדים יכול לספק פתרון מצוין למורפולוגיה עצבית 1, 20. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות מסוימות: הביטוי לעתים קרובות בלתי הנמנע של ה-GFP בתאים מרובים יכול לטשטש את המבנה של תאי עצב בודד וקו נהג GAL4 לא יהיה זמין לנהוג ביטוי בתא עצב מסוים של ריבית. MARCM (ניתוח פסיפס עם ציטוטמרקר סלולרי ressible) שיטה 8 יכול לספק תיוג של מהות כל נוירון ברמת התא הבודדה, אך לא ניתן להשתמש בהצלחה בעובר והזחל מוקדם בגלל התחלופה האיטית של חלבון GAL80. בהתחשב במגבלות אלה של תיוג גנטי, אנו מאמינים כי הזרקת צבע נוירון הבודדה בעובר דרוזופילה נשארת טכניקה חשובה וראויה ליישום רחב יותר. כדי לקדם מטרה זו, אנו מספקים כאן תיאור מפורט של השיטה. המחשת כוחה מסופקת על ידי החשבון האחרון שלנו על המורפולוגיה של הסט השלם של interneurons בneuromeres בטן של העובר מאוחר תסיסנית 14. מחקר זה, שחשף גם את השונות מורפולוגית של סוגי תאים עצביים בודדים ועקרונות של ארגון neuromere במערכת העצבים המרכזיים של העובר, לא היה אפשרי עם כל שיטת תיוג זמינה אחרת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> DAB </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב100 מ&quot;מימ TRIS-HCL, pH 7.4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen בדיקות / מולקולריות </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באתנול </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">פורמלדהיד</a> </td><td> מרק Millipore </td><td></td><td> 7,4% ב PBS </td> &lt;/ P&gt; <tr><td> גליצרול </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">רוט</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% ב PBS </td></tr><tr><td> Heptane דבק </td><td> Beiersdorf AG </td><td> צ&#39;לו 31-39-30 * </td><td> לדלל CA. 1-1 עם n-heptane </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">רוט</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> מעבדות וקטור </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ confocal </td><td> ליקה </td><td> TCS SP2 </td><td> כדי להציג ולתעד labelings בפלואורסצנטי </td></tr><tr><td> DC -mplifier </td><td> דרגן חברה </td><td> אבן הפינה ION-100 </td><td> כדי לבצע את labelings </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">מנזל</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 מ&quot;מ x 18 </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">מנזל</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 מ&quot;מ x 60 </td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td> ליקה </td><td> MZ8 </td><td> להכין וdisect עוברים </td></tr><tr><td> נימים שטוחות </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> מ&quot;מ קוטר חיצוני 1; עובי 0.1 מ&quot;מ glas </td></tr><tr><td> הזרקת נימים </td><td> מוצרי מדע </td><td> 100 GB TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> R micromanipulator </td><td> ליקה </td><td></td><td> כדי לבצע את labelings </td></tr><tr><td> דגם P-97 </td><td> סאטר מכשירים </td><td></td><td> למשוך נימים </td></tr><tr><td> שקופיות אובייקטים </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ המדעי </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> כדי להציג labelings לאחר photoconversion </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ המדעי </td><td> אולימפוס </td><td> BX50 </td><td> כדי לבצע את labelings </td></tr><tr><td> מצלמת וידאו הסוני MC3255 </td><td> סוני / AVT הורן </td><td> סוני MC3255 </td><td> כדי להקליט labelings לאחר photoconversion </td></tr></tbody></table> טבלת 1.

labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster

במאמר זה יתאר כיצד בנפרד לתייג תאי עצב במערכת העצבים המרכזיים העוברית של דרוזופילה melanogaster על ידי ההזרקה של juxtacellular DiI סמן lipophilic ניאון הממברנה. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מורפולוגיה של תאים עצבית בפירוט רב. אפשר לתייג את כל תאים במערכת העצבים מרכזיים: גופי תא של הנוירונים היעד הם דמיינו תחת אופטיקה DIC או על ידי ביטוי של סמן גנטי ניאון כגון ה-GFP. לאחר תיוג, DiI יכול להפוך לחום קבוע כתם ידי photoconversion כדי לאפשר הדמיה של מורפולוגיה תא עם אור מועבר ואופטיקה DIC. לחלופין, את התאים שכותרת DiI-ניתן לצפות ישירות עם מיקרוסקופיה confocal, המאפשרים חלבוני כתב ניאון הציגו גנטי להיות colocalised. הטכניקה יכולה לשמש בכל בעל חיים, ללא קשר לגנוטיפ, כך שניתן לנתח פנוטיפים מוטציה ברזולוצית תא בודדה.

איור 4 ממחיש תוצאות טיפוסיות של הטכניקה, שאנו מתארים כאן. האיור 4A מראה דוגמה של interneuron אחת DiI מלא שphotoconverted נקי. זה יפה ממחיש את כמות הפרטים אלה הצעת הכנות. כאשר מתחת אופטיקה DIC ההקשר המרחבי של התא המסומן בתוך הרקמה הסובבת הלא מתויגת-הופך לגלוי, למשל</em...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים, המאפשר הניתוח של מורפולוגיה עצבית על ידי אור או שודר או מיקרוסקופיה confocal.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

תרופות משלוח מערכתית מקומי לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית מודלים מכרסמים

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...