Name: labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00
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私達は私達の研究室で単一ニューロン標識法の2つのわずかに異なるバリアントを使用している。違いは胚コレクション、dechorionisation、devitellinisationおよび胚フィレットの手順に関連しています。 図1は変異体の共通の発散と手順の概要を説明します。 1。仕分けインジェクション用の胚の解剖及びマイクロピペット用マイクロ針の作製<ol><li>胚の解剖用ガラ...

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	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+growth+cone+to+synapse:+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron.">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures.">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li><li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages.">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing.">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+tungsten+microelectrode.">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li><li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations.">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li><li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics,+filopodial+length,+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile.">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li><li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS:+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron.">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li><li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+grasshopper+to+Drosophila:+a+common+plan+for+neuronal+development.">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li><li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect,+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata.">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li><li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation,+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede,+Ethmostigmus+rubripes+(Brandt).">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li><li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo:+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery.">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li><li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods:+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans.">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li><li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila.">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li></ol>

モデル系としてショウジョウバエの一つの主要な利点は、単一細胞のレベルでの発達と機能の解析を可能にすることである。これは、細胞の種類の多様性は非常に高く、隣接する細胞の機能と形態が全く異なることがあります神経系に関しては特に便利です。 ここでお見せする方法は、永久染色剤や蛍光顕微鏡法による直接調べに変換することができる色素を持?...

個々の細胞レベルでの神経形態の知識は神経接続とCNS機能を理解するための重要な前提条件です。このように、神経科学の黎明期から、研究者は、単一細胞標識技術（この問題の歴史的な治療のために7を参照）を開発しようとしてきた。そのようなゴルジ染色などの古典的な方法は、神経形態の優れた解像度を提供しますが、一つは染色はランダムに発生するように、指示された方法で、神経細胞の特定の種類にラベルを付けるために求める場合は適していません。微小電極から色素の細胞内またはjuxtacellular注射することで、単一細胞を染色するための方法の開発は、特定のラベリングの要件に対処した。 ショウジョウバエへの単一ニューロン染料注入のアプリケーションが原因生物とニューロンの両方のサイズが小さい、大きな課題を提示した。 ショウジョウバエの胚のそれにもかかわらず、単一のニューロンの染色</em&gt;ニューロンはコーリー·グッドマン15の研究室では、1980年代半ばに達成された。方法は極めて有用であったし、最後の20〜30年（ 例えば、2、10）以上、ショウジョウバエの神経発達のメカニズムにいくつかの重要な洞察を提供してきましたが、多くの労働者が主な理由として、その技術的な要求のために、それを敬遠してきた。 ショウジョウバエのニューロンの標識のための遺伝的技術のより近年の可用性は、単一ニューロンの色素注入の不人気に貢献してきました。膜標的化GFPコンストラクトのGAL4指向発現は、神経形態学1、20の優れた分解能を提供することができます。しかし、この方法は、一定の制限があります：複数の細胞におけるGFPのしばしば不可避式は個々のニューロンの構造を分かりにくくすることができますとGAL4ドライバーラインは、関心のある特定の神経細胞での発現を駆動するのに利用可能でないかもしれません。 MARCM（REPを持つモザイク解析ressible細胞マーカー）法8は、個々 の細胞レベルで、本質的に任意のニューロンを標識しましたが、正常になぜならGAL80タンパク質の代謝回転の遅い胚と早期幼虫に使用することはできませんを提供することができます。 遺伝標識のこれらの制限を考えて、私たちは、 ショウジョウバエの胚において、単一ニューロンの色素注入は重要な手法のままで、広範なアプリケーションに値すると信じています。この目標を推進するために、我々はここで方法の詳細な説明を提供します。そのパワーのイラストが遅くショウジョウバエの胚14の腹部neuromeresにおける介在の完全なセットの形態の我々の最近のアカウントで提供されています。個々の神経細胞種の形態学的変動と胎児の中枢神経系における神経分節組織の原則の両方を明らかにしたこの研究では、現在使用可能な他の標識法では不可能だったでしょう。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> DAB </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 100mMのトリス-HCl、pH 7.4で2-3 mg / mlの</td></tr><tr><td> DiIを</td><td>インビトロジェン/モレキュラープローブ</td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td>エタノール中で1 mg / mlの</td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">ホルムアルデヒド</a> </td><td>メルクミリポア</td><td></td><td> PBS中の7,4％ </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td>グリセロール</td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">ロート</a> </td><td> 3783 </td><td> PBS中で70パーセント</td></tr><tr><td>ヘプタングルー</td><td>バイヤスドルフ社</td><td>チェロ31-39-30 * </td><td> caを薄める。 n-ヘプタンで1から1 </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1X </td></tr><tr><td>トリス</td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">ロート</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> TCS SP2 </td><td>蛍光で標識化して表示し、文書化する</td></tr><tr><td> DC -mplifier </td><td>ドラガン·コーポレーション</td><td>礎石ION-100 </td><td>ラベル付けを実行する</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">メンツェル</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18のmm </td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">メンツェル</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24×60ミリメートル</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> MZ8 </td><td>胚を準備しdisectする</td></tr><tr><td>フラットキャピラリ</td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td>外径1ミリメートル; GLAS厚さ0.1ミリメートル</td></tr><tr><td>注射毛細血管</td><td>サイエンス事業</td><td> 100 GBのTF 8P </td><td></td></tr><tr><td>マニピュレーターR </td><td>ライカ</td><td></td><td>ラベル付けを実行する</td></tr><tr><td>モデルP-97 </td><td>サターインスツルメンツ</td><td></td><td>毛細血管を引っ張る</td></tr><tr><td>オブジェクトスライド</td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeldスペリオル</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td>科学的な顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axioskop 2名言</td><td>光変換後にラベル付けを表示する</td></tr><tr><td>科学的な顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX50 </td><td>ラベル付けを実行する</td></tr><tr><td>ソニーMC3255ビデオカメラ</td><td>ソニー/ AVTホーン</td><td>ソニーMC3255 </td><td>光変換後ラベリングを記録する</td></tr></tbody></table> 表1。

labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster

この記事では、我々は個々に親油性の蛍光膜マーカーDiIのjuxtacellular注射によるキイロショウジョウバエの胚中枢神経系の神経細胞をラベル付けする方法を説明します。この方法は、非常に詳細に神経細胞形態の可視化を可能にします。それは、CNS内の任意のセルにラベルを付けることが可能です：標的ニューロンの細胞体は、DIC光学の下やGFPなどの蛍光遺伝子マーカーの発現によって可視化されています。標識後、DIIは、透過光とDIC光学系と細胞形態の可視化を可能にすることにより光電永久茶色の染色に変換することができます。あるいは、DiI標識細胞を遺伝子導入した蛍光レポータータンパク質がcolocalisedすることを可能にする、共焦点顕微鏡で直接観察することができます。技術はそれが可能な単一細胞の解像度で変異体の表現型を解析すること、遺伝子型にかかわらず、任意の動物に使用することができます。

図4は技術の典型的な結果を示して、私たちはここで説明しています。 図4Aは、きれいにphotoconvertedたDiIを埋め単一介在ニューロンの例を示しています。それは、うまくこれらの準備が提供する詳細情報の量を示しています。非標識の周囲の組織内に標識された細胞の空間的な文脈が見えるようになり、DIC光学の下で見たときに、皮質内および神経網内の繊維投影の?...

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Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;透過光または共焦点顕微鏡法のいずれかによる神経形態の分析を可能にする胚。

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

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齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

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