Name: labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra DFG til GMT

Vi har brukt to litt forskjellige varianter av enkelt Nevron merking Fremgangsmåte i våre laboratorier. Forskjellene er knyttet til fosteret samling, dechorionisation, devitellinisation og embryo filetering skritt. Figur 1 gir en oversikt over de vanligste og divergerende trinn variantene. 1. Utarbeidelse av Micro-nåler for Embryo Dissection og Mikropipetter for Dye Injection <ol><li> Glass nåler for embryo disseksjon er hentet fra glass kapillærer (1 mm diameter og 0...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+growth+cone+to+synapse:+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron.">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures.">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li><li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages.">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing.">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+tungsten+microelectrode.">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li><li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations.">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li><li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics,+filopodial+length,+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile.">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li><li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS:+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron.">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li><li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+grasshopper+to+Drosophila:+a+common+plan+for+neuronal+development.">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li><li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect,+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata.">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li><li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation,+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede,+Ethmostigmus+rubripes+(Brandt).">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li><li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo:+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery.">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li><li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods:+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans.">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li><li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila.">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li></ol>

En stor fordel med Drosophila som modellsystem er at det tillater analyse av utvikling og funksjon av nivået av enkeltceller. Dette er spesielt nyttig om nervesystemet, hvor mangfoldet av celletyper er eksepsjonelt høy og funksjon og morfologi av nabocellene kan være helt annerledes. Metoden vi her presenterer tillater merking av individuelle nevroner med et fargestoff som kan enten omdannes til et permanent flekk eller undersøkt direkte ved fluorescens mikroskopi. Det avslører...

Kjennskap neuronal morfologi på nivået av individuelle celler er en viktig forutsetning for å forstå neuronal tilkobling og CNS-funksjonen. Derfor, fra de tidligste dagene av nevrovitenskap, har forskerne forsøkt å utvikle enkelt celle merking teknikker (se 7 for en historisk behandling av denne saken). Klassiske metoder som Golgi farging gir utmerket oppløsning av neuronal morfologi, men er ikke egnet hvis man søker å merke en spesiell type nervecelle i en rettet måte, som farging oppstår i en tilfeldig måte. Utvikling av metoder for farging enkeltceller ved intracellulær eller juxtacellular injeksjon av fargestoffer fra en microelectrode adressert kravet om spesifikk merking. Anvendelsen av enkelt Nevron fargestoff injeksjon til Drosophila presentert en stor utfordring, på grunn av den lille størrelsen av både organismen og dens neuroner. Likevel, enkelt Nevron farging av embryonale Drosophila </em&gt; Nevroner ble oppnådd i midten av 1980-tallet i laboratoriet av Corey Goodman 15. Mens metoden har vært utpreget nyttig og har gitt noen viktige innsikter i mekanismene for neuronal utvikling i Drosophila over de siste 20-30 år (2 f.eks, 10), har mange arbeidstakere skvatt unna det, hovedsakelig på grunn av sine tekniske krav. Tilgjengeligheten i de senere år av genetiske teknikker for neuronal merking i Drosophila har også bidratt til upopularitet av enkelt Nevron fargestoff injeksjon. GAL4-regissert uttrykk for membran målrettede GFP konstruerer kan gi god oppløsning av nevrale morfologi 1, 20. Imidlertid har denne metoden visse begrensninger: den ofte uunngåelig uttrykk for GFP i flere celler kan skjule strukturen i enkelte nerveceller og en GAL4 driver linje kan ikke være tilgjengelig for å kjøre uttrykk i en bestemt nevron av interesse. Den MARCM (Mosaic Analyse med Repressible Cell Marker) metode 8 kan gi merking av hovedsak enhver Nevron på individ cellenivå, men kan ikke med hell brukes i embryo og tidlig larven grunn av treg omsetningen av GAL80 proteinet. Gitt disse begrensningene av genetisk merking, tror vi at enkelt Nevron fargestoff injeksjon i Drosophila embryo forblir en verdifull teknikk og fortjener bredere anvendelse. Å fremme dette målet, gir vi her en detaljert beskrivelse av metoden. En illustrasjon av sin makt er gitt av vår siste redegjørelse for morfologi av komplett sett av interneurons i abdominal neuromeres på slutten Drosophila embryo 14. Denne studien, som viste både morfologiske variasjon av individuelle nevrale celletyper og prinsippene for neuromere organisasjon i CNS av embryoet, ville ikke vært mulig med noen annen tiden tilgjengelig merking metoden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENSER </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml i 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Dii </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml i etanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldehyd</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% i PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glyserol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% i PBS </td></tr><tr><td> Heptan Lim </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> fortynne ca. 1-1 med n-Heptan </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> UTSTYR </td></tr><tr><td> Confocal mikroskop </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> å vise og dokumentere labelings i fluorescens </td></tr><tr><td> DC - enmplifier </td><td> Dragan Corporation </td><td> Hjørnestein ION-100 </td><td> å utføre labelings </td></tr><tr><td> Dekkglass </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Dekkglass </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Disseksjonsmikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> å forberede og disect embryoer </td></tr><tr><td> Flat Kapillærer </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> ytre diameter 1 mm; glas tykkelse 0,1 mm </td></tr><tr><td> Injeksjon Kapillærer </td><td> Vitenskap Produkter </td><td> GB 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator R </td><td> Leica </td><td></td><td> å utføre labelings </td></tr><tr><td> Modell P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> å trekke kapillærer </td></tr><tr><td> Objekt lysbilder </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Vitenskapelig Microscope </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> å vise labelings etter photoconversion </td></tr><tr><td> Vitenskapelig Microscope </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td> å utføre labelings </td></tr><tr><td> Sony MC3255 Videokamera </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> å spille labelings etter photoconversion </td></tr></tbody></table> Tabell 1.

labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster

I denne artikkelen beskriver vi hvordan du individuelt merke nevroner i de embryonale CNS av Drosophila melanogaster etter juxtacellular injeksjon av lipofile fluorescerende membran markør DII. Denne metoden gjør det mulig visualisering av neuronal celle morfologi i stor detalj. Det er mulig å merke en celle i CNS: celle organer av target nevroner er visualisert henhold DIC optikk eller ved ekspresjon av et fluorescerende genmarkør eksempel GFP. Etter merking kan DII bli omdannet til en permanent brun flekk ved photoconversion å tillate visualisering av cellemorfologi med overført lys og DIC optikk. Alternativt kan Dii-merkede celler observeres direkte med konfokalmikroskopi, slik genetisk innført fluorescerende reporter proteiner for å bli colocalised. Teknikken kan brukes i noe dyr, uavhengig av genotype, som gjør det mulig å analysere mutant fenotyper ved enkelt celle oppløsning.

Figur 4 illustrerer typiske resultater av teknikken, beskriver vi her. Fig. 4A viser et eksempel på en Dii fylt enkelt interneuron som ble ren photoconverted. Det viser pent mengden detaljer disse forberedelsene tilbudet. Sett under DIC optikk den romlige konteksten av den merkede celle innenfor det ikke-merkede omliggende vev blir synlig, f.eks plasseringen av cellen organ innen cortex og av fiber projeksjon innenfor neuropile. Figur 4B</s...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Vi presenterer en teknikk for merking enslige nevroner i sentralnervesystemet (CNS) av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer, som tillater analyse av neuronal morfologi ved enten overført lys eller konfokal mikroskopi.

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging of Stem Cell implantasjon i sentralnervesystemet av Mus

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade Paradigm for å etterforske Central Nervous System Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Avhør av Central Nervous System Translatome av Polyribosome Fraksjone

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optisk Clearing av musen sentralnervesystemet Bruke Passiv CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...