Name: labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från DFG till GMT

Vi har använt två något olika varianter av enda neuron märkningsmetod i våra laboratorier. Skillnaderna avser embryosamlingen, dechorionisation, devitellinisation och embryo steg filetering. Figur 1 ger en översikt över de vanligaste och divergerande steg varianterna. 1. Beredning av Micro-nålar för embryon Dissection och Mikropipetter för Dye injektion <ol><li> Glas nålar för embryo dissektion dras från glaskapillärer (1 mm i diameter och 0,1 mm väggtjockle...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+growth+cone+to+synapse:+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron.">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures.">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li><li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages.">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing.">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+tungsten+microelectrode.">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li><li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations.">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li><li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics,+filopodial+length,+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile.">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li><li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS:+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron.">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila.">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li><li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+grasshopper+to+Drosophila:+a+common+plan+for+neuronal+development.">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li><li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect,+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata.">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li><li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation,+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede,+Ethmostigmus+rubripes+(Brandt).">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li><li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo:+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery.">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li><li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods:+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans.">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li><li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila.">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li></ol>

En stor fördel med Drosophila som ett modell-system är att det tillåter analys av utveckling och funktion på nivån av enskilda celler. Detta är särskilt användbart när det gäller nervsystemet, där mångfalden av celltyper är exceptionellt hög och funktion och morfologi av angränsande celler kan vara helt annorlunda. Den metod som vi presenterar här tillåter märkning av enskilda neuroner med ett färgämne som antingen kan omvandlas till en permanent fläck eller und...

Kunskap om neuronal morfologi vid enskilda celler är en viktig förutsättning för att förstå nervkopplingar och CNS-funktion. Således, från de tidigaste dagarna av neurovetenskap, har forskare försökt utveckla enskilda tekniker cell märkning (se 7 för en historisk behandling av denna fråga). Klassiska metoder såsom Golgi färgning ger utmärkt upplösning av neuronal morfologi men är inte lämpliga om man försöker märka en viss typ av neuron i ett riktat sätt, såsom färgning sker på ett slumpmässigt sätt. Utvecklingen av metoder för färgning enstaka celler genom intracellulära eller juxtacellular injektion av färgämnen från en mikroelektrod riktat kravet på särskild märkning. Tillämpningen av enda neuron färgämne injektion till Drosophila en stor utmaning på grund av den lilla storleken på både organismen och dess nervceller. Trots enda neuron färgning av embryonala Drosophila </em&gt; Neuroner uppnåddes i mitten av 1980-talet i laboratorium Corey Goodman 15. Medan metoden har i högsta grad användbar och har gett några viktiga insikter mekanismer för neuronal utveckling i Drosophila de senaste 20-30 åren (t.ex. 2, 10), har många arbetare skyggat från det, till stor del på grund av dess tekniska krav. Tillgången på senare år av genetiska tekniker för neuronal märkning i Drosophila har också bidragit till impopularitet enda neuron färgämne injektion. GAL4-riktad uttryck av membran riktade GFP konstruktioner kan ge utmärkt upplösning av neurala morfologi 1, 20. Emellertid har denna metod vissa begränsningar: det ofta oundviklig uttryck av GFP i flera celler kan skymma struktur i enskilda neuroner och en GAL4 förare linje kanske inte är tillgängliga för att driva expression i en särskild neuron av intresse. Den marcm (Mosaik analys med ett repressible cellmarkör) metod 8 kan ge märkning av väsentligen varje neuron på individuell cellnivå, men kan inte med framgång användas i embryot och tidig larv grund av den långsamma omsättningen av GAL80-proteinet. Med tanke på dessa begränsningar genetisk märkning, tror vi att enda neuron färgämne injektion i Drosophila embryot fortfarande en värdefull teknik och förtjänar bredare tillämpning. För att främja detta mål, tillhandahåller vi här en detaljerad beskrivning av metoden. En illustration av sin makt ges av vår senaste hänsyn till morfologi fullständig uppsättning interneuronen i buken neuromeres av den sena Drosophila embryot 14. Denna studie, som visade både den morfologiska variationen av individuella neuronala celltyper och principerna för neuromere organisation i CNS hos embryot, skulle inte ha varit möjligt med någon annan tillgänglig märkning metod.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENSER </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml i 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Dil </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml i etanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldehyd</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% i PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glycerol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% i PBS </td></tr><tr><td> Heptan Lim </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> utspädd ca. 1 till 1 med n-heptan </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> UTRUSTNING </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> att visa och dokumentera labelings i fluorescens </td></tr><tr><td> DC - amplifier </td><td> Dragan Corporation </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> att utföra labelings </td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> att förbereda och disect embryon </td></tr><tr><td> Flat Kapillärer </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> ytterdiameter 1 mm, glas tjocklek 0,1 mm </td></tr><tr><td> Injektion Kapillärer </td><td> Vetenskap Produkter </td><td> S 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulator R </td><td> Leica </td><td></td><td> att utföra labelings </td></tr><tr><td> Modell P-97 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> att dra kapillärer </td></tr><tr><td> Object Slides </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Vetenskaplig mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 MOT </td><td> att visa labelings efter photoconversion </td></tr><tr><td> Vetenskaplig mikroskop </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td> att utföra labelings </td></tr><tr><td> Sony MC3255 videokamera </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> att spela in labelings efter photoconversion </td></tr></tbody></table> Tabell 1.

labeling of single cells in the central nervous system of drosophila melanogaster

I den här artikeln beskriver vi hur individuellt för att märka neuroner i embryonala CNS av Drosophila melanogaster genom juxtacellular injektion av lipofila fluorescerande membran markör Dil. Denna metod medger visualisering av neuronal cellmorfologi i detalj. Det är möjligt att märka någon cell i CNS: cellkroppar mål nervceller visualiseras i DIC optik eller genom uttryck av en fluorescerande genetisk markör som GFP. Efter märkning kan Dil omvandlas till en permanent brun fläck på photoconversion att tillåta visualisering av cellmorfologi med ljus och DIC optik. Alternativt, kan de Dil-märkta cellerna observeras direkt med konfokalmikroskopi, möjliggör genetiskt införts fluorescerande reporter proteiner som skall colocalised. Tekniken kan användas i alla djur, oavsett av genotyp, vilket gör det möjligt att analysera mutanta fenotyper vid enda cell upplösning.

Figur 4 illustrerar typiska resultat av tekniken, beskriver vi här. Figur 4A visar ett exempel på en fylld Dil enda interneuron som rent var photoconverted. Det visar fint hur mycket detaljer dessa preparat erbjuder. När den betraktas under DIC optik den rumsliga ramen för den märkta cellen inuti den icke-märkta omgivande vävnad blir synlig, t.ex. positionen av cellkroppen i cortex och av fibern utskjutande inuti neuropile. Figur 4B</...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Vi presenterar en teknik för märkning enstaka neuroner i det centrala nervsystemet (CNS) hos<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon, som tillåter analys av neuronal morfologi av antingen ljus eller konfokalmikroskopi.

Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models (Video) | JoVE

Systemisk och lokal Drug Delivery för behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet i gnagarmodeller

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos (Video) | JoVE

Visualisering av embryonala nervsystemet i hela-fäste Drosophila Embryon

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System (Video) | JoVE

Synnerven transection: En modell av Vuxen Neuron apoptos i det centrala nervsystemet

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice (Video) | JoVE

Multimodal Imaging av stamceller implanteras i centrala nervsystemet hos möss

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System (Video) | JoVE

Produktion av Lentiviral vektorer för att omvandla Celler från det centrala nervsystemet

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila (Video) | JoVE

En skada Paradigm att undersöka centrala nervsystemet Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System (Video) | JoVE

Direkt Intraventrikulär tillförsel av läkemedel till Gnagare Centrala nervsystemet

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections (Video) | JoVE

Immunohistokemisk analys i Rat centrala nervsystemet och perifera lymfkörtelvävnadssnitt

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation (Video) | JoVE

In vivo Förhör av centrala nervsystemet Translatome av Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System (Video) | JoVE

In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...