Name: live imaging of apoptotic cell clearance during drosophila embryogenesis
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en Marie Curie Reintegrering Grant (IRG249084). Vi takker alle medlemmer av Kurant laboratoriet.

Å følge dynamikken i apoptotiske cellen klaring in vivo to populasjoner av celler må merkes: fagocyttiske celler og apoptotiske celler. For å markere fagocyttiske celle populasjoner vi bruker en Drosophila linje som inneholder simulere cytGFP markør, som betegner utelukkende fagocyttiske cellene i embryoet: makrofager, gliaceller og ectoderm åtte. Man kan bruke ulike markører for fagocyttiske celler, inkludert linjene som inneholder en hemocyte-sp...

<ol>
	<li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+to+die+for:+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm,+fly+and+mouse.">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+signaling:+you+can+touch,+but+you+can't+eat.">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+elegant+complexity.">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis.">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li><li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+the+CNS+clear:+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila.">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li><li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons.">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li><li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos.">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li><li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved.">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li></ol>

Apoptotisk celle klaring er en kritisk siste stadium av apoptose, noe som er svært dynamisk. Derfor sanntid studier av prosessen er av største betydning. Her beskriver vi en protokoll som muliggjør overvåkning av apoptotiske celle klaring i levende utviklingsland Drosophila embryoer. I denne fremgangsmåte må to populasjoner av celler merkes med spesifikke markører: apoptotiske celler og fagocytter. De simu-cytGFP reporter er egnet til å overvåke fagocytiske makrofager, gliaceller og Ektoderm s...

Riktig eliminering av uønskede eller avvikende celler gjennom apoptose og påfølgende phagocytosis er avgjørende for embryonal utvikling så vel som for vev homeostase i voksen. Fagocytose av apoptotiske celler eller apoptotiske celle klaring er en svært dynamisk prosess som fortsetter i fire trinn: (1) rekruttering av fagocytter til apoptotiske cellen (&#39;finne-meg &quot;), (2) anerkjennelse av cellen som et mål for fagocytose ( &#39;spise-me&#39;) og (3) engulfment, etterfulgt av (4) phagosome modning og nedbrytningen av apoptotiske partikkel 1-5. Det finnes to typer av fagocytter: &quot;profesjonell&quot; makrofager og umodne dendrittiske celler, og &quot;ikke-profesjonelle &#39;vev-resident nabocellene, som er avgjørende for apoptotiske celle klaring under metazoan utvikling 6,7. I Drosophila utvikling, skjer eliminering av overflødige celler gjennom apoptose i tre main faser, først i midten til slutten av embryo, deretter i midten av puppe, og igjen i tidlig voksen. Under embryogenese apoptotic partiklene er fjernet av &quot;profesjonell&quot; fagocytter, makrofager, og av de &quot;ikke-profesjonell&quot; ectoderm og gliaceller 8,9. I vårt tidligere arbeid har vi identifisert en fagocytisk reseptor, Six-mikron-under (SIMU), som uttrykkes utelukkende i fagocyttiske celler under embryogenese. Ved hjelp av simulatoren promoter vi generert en spesifikk markør for fagocyttiske celle populasjoner (simulere cytGFP) som gjør oss i stand til å overvåke makrofager, ectoderm og gliaceller samtidig i en live utvikling av embryo 8. I tillegg, ved hjelp av spesifikke markører for apoptotiske celler i ulike stadier av apoptose, er vi i stand til å følge dynamikken i apoptotiske cellen klaring in vivo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Annexin V </td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>A35108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PhiPhiLux G2D2</td>
 <td>OncoImmunin</td>
 <td>A304R2G-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LysoTracker</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-7528</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Halocarbon oil 700</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H8898</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capillary tubing</td>
 <td>FHC </td>
 <td>30-30-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Strainer</td>
 <td>SPL</td>
 <td>93100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paintbrush</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live imaging of apoptotic cell clearance during drosophila embryogenesis

Riktig eliminering av uønskede eller avvikende celler gjennom apoptose og påfølgende phagocytosis (apoptotiske celle clearance) er avgjørende for normal utvikling i alle metazoan organismer. Apoptotiske celle clearance er en svært dynamisk prosess nært forbundet med celledød; unengulfed apoptotiske celler er knapt sett in vivo under normale forhold. For å forstå de ulike trinnene i apoptotiske cellen klarering og sammenligne &quot;profesjonell&quot; fagocytter - makrofager og dendrittiske celler til &quot;ikke-profesjonelle&quot; - vev-resident nabocellene, in vivo levende avbildning av prosessen er meget verdifull. Her beskriver vi en protokoll for å studere apoptotiske celle klaring i levende Drosophila embryoer. Å følge dynamikken i forskjellige trinnene i fagocytose vi bruker spesifikke markører for apoptotiske celler og phagocytes. I tillegg kan vi overvåke to phagocyte systemer i parallell: &quot;profesjonell&quot; makrofager og &quot;semi-professional &#39;gliaceller i den tredje sentrale nervesystemet (CNS). Metoden beskrevet her benytter Drosophila embryo som en utmerket modell for sanntids studier av apoptotisk celle klaring.

Representative rammer fra en film der apoptotiske celler er merket med Annexin V, og gliaceller, ectoderm og makrofager er merket med simulere cytGFP er vist i figur 2. Hver ramme er en projeksjon av tre skiver 2 mikrometer hver. Embryo av scenen 15 er riktig plassert viser embryonale CNS i midten med godt merket gliaceller (g). Makrofager (m), som er det meste utenfor CNS, viser sterk cytoplasmic GFP uttrykk. Ectodermal celler er også merket med cytoplasmatisk GFP...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis at JoVE.com

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Her beskriver vi en effektiv metode for å studere dynamikken i apoptotiske cellen klaring<em&gt; In vivo</em&gt;. Denne metoden benytter leve<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer som en kraftig modell for overvåking fagocytose av apoptotiske celler ved hjelp av spesifikk merking av apoptotiske celler og phagocytes.

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Forbereder Individuell Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Lever Imaging av GFP-merket Proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging of Protein Aggregation i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode for Live Imaging av Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreseptorcellene

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologisk Analyse spermatogenese: Skarp og Faste Preparater av<em&gt; Drosophila</em&gt; Testikler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

In vivo Biosensor Tracks Non-apoptotiske caspase aktivitet i Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...