Name: live imaging of apoptotic cell clearance during drosophila embryogenesis
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett Marie Curie återintegreringsbidrag (IRG249084). Vi tackar alla medlemmar i Kurant laboratoriet.

För att följa dynamiken i apoptotiska celler clearance in vivo två populationer av celler skall märkas: fagocytiska celler och apoptotiska celler. För att markera fagocytiska cellpopulationer vi använder en Drosophila rad som innehåller simu-cytGFP markör, som märker uteslutande fagocytiska celler i embryot: makrofager, glia och ectoderm 8. Man kan använda olika markörer för fagocytceller, inklusive linjer som innehåller en hemocyte-specifik...

<ol>
	<li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+to+die+for:+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm,+fly+and+mouse.">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+signaling:+you+can+touch,+but+you+can't+eat.">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+elegant+complexity.">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis.">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li><li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+the+CNS+clear:+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila.">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li><li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons.">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li><li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos.">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li><li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved.">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li></ol>

Apoptotisk cell clearance är en kritisk sista stadiet av apoptos, vilket är mycket dynamisk. Därför realtid studier av processen är av yttersta vikt. Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör övervakning av apoptotiska celler clearance i levande utvecklingsländer Drosophila embryon. I den här proceduren måste två populationer av celler märkas med specifika markörer: apoptotiska celler och fagocyter. Den simu-cytGFP reportern är lämplig för övervakning av fagocytiska makrofager, gl...

Den korrekt eliminering av oönskade eller avvikande celler genom apoptos och efterföljande fagocytos är avgörande för embryonal utveckling samt för vävnad homeostas i den vuxna. Fagocytos av apoptotiska celler eller apoptotiska celler clearance är en mycket dynamisk process som sker i fyra steg: (1) rekrytering av fagocyter till apoptotiska celler (&quot;hitta-mig&quot;), (2) erkännande av cellen som ett mål för fagocytos ( &quot;äta-me &#39;) och (3) helt omslutande följt av (4) phagosome mognad och nedbrytning av den apoptotiska partikeln 1-5. Det finns två typer av fagocyter: &quot;professionella&quot; makrofager och omogna dendritiska celler, och den &quot;icke-professionella&quot; tissue hemmahörande angränsande celler, vilket är avgörande för apoptotiska celler clearance under metazoan utveckling 6,7. I Drosophila utveckling sker eliminering av överflödiga celler genom apoptos i tre main faser, först i mitten eller slutet av embryo, sedan i mitten av puppa, och igen i tidig vuxen. Under fosterutvecklingen apoptotiska partiklar avlägsnas genom &quot;professionella&quot; fagocyter, makrofager, och av &quot;icke-professionell&quot; ektoderm och glia 8,9. I vårt tidigare arbete har vi identifierat ett fagocytisk receptor, Six-mikron-under (SIMU), vilket uttrycks enbart i fagocytiska celler under fosterutvecklingen. Använda simu promotorn vi genererat en specifik markör för fagocytiska cell populationer (simu-cytGFP) vilket gör att vi kan övervaka makrofager, ektoderm och glia samtidigt i ett levande embryo under utveckling 8. Dessutom, genom att använda särskilda markörer för apoptotiska celler i olika stadier av apoptos, kan vi följa dynamiken i apoptotiska celler clearance in vivo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Annexin V </td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>A35108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PhiPhiLux G2D2</td>
 <td>OncoImmunin</td>
 <td>A304R2G-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LysoTracker</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-7528</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Halocarbon oil 700</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H8898</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capillary tubing</td>
 <td>FHC </td>
 <td>30-30-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Strainer</td>
 <td>SPL</td>
 <td>93100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paintbrush</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live imaging of apoptotic cell clearance during drosophila embryogenesis

Den korrekt eliminering av oönskade eller avvikande celler genom apoptos och efterföljande fagocytos (apoptotiska celler clearance) är avgörande för normal utveckling i alla flercelliga organismer. Apoptotisk cell clearance är en mycket dynamisk process intimt förknippade med celldöd, unengulfed apoptotiska celler knappt sett in vivo under normala förhållanden. För att förstå de olika stegen i apoptotiska celler clearance och jämföra &quot;professionella&quot; fagocyter - makrofager och dendritiska celler till &quot;icke-professionell&quot; - vävnad bosatta angränsande celler, in vivo levande avbildning av processen är oerhört värdefull. Här beskriver vi ett protokoll för att studera apoptotiska celler clearance i levande Drosophila embryon. För att följa dynamiken i olika steg i fagocytos vi använder specifika markörer för apoptotiska celler och fagocyter. Dessutom kan vi följa två phagocyte system parallellt: &quot;professionella&quot; makrofager och &quot;semi-professional &#39;Glia i utvecklingsländerna centrala nervsystemet (CNS). Den metod som beskrivs här använder Drosophila embryot som en utmärkt modell för verkliga tidsstudier av apoptotiska celler avslut.

Representativa bildrutor från en film, i vilken apoptotiska celler är märkta med Annexin V och glia, ektoderm och makrofager är märkta med simu-cytGFP visas i figur 2. Varje ram är en projektion av tre skivor 2 pm vardera. Embryot i steget 15 är korrekt placerad visar embryonala CNS i mitten med väl märkta glia (g). Makrofager (m), som oftast utanför CNS, visa stark cytoplasmic GFP uttryck. Ektodermala celler är också märkta med cytoplasmiskt GFP (e). M...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis at JoVE.com

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Här beskriver vi en effektiv metod för att studera dynamiken i apoptotisk cell clearance<em&gt; In vivo</em&gt;. Denna metod använder bor<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon som en kraftfull modell för övervakning fagocytos av apoptotiska celler med särskild märkning av apoptotiska celler och fagocyter.

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Live avbildning av gliacellsmarkörer migration i Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live avbildning av Drosophila melanogaster Embryonala Hemocyte Flyttningar

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Beredning av Utveckla och vuxna Drosophila Brains och retinae för Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

En omvänd Genetisk strategi till Test Funktionell Redundans under fosterutvecklingen

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Framställning av individuella Drosophila Egg Chambers för Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Den Tomat / GFP-FLP / FRT Metod för Live avbildning av Mosaic vuxen<em&gt; Drosophila</em&gt; ljusmätare celler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologisk analys av Spermatogenesen: Live och fasta Beredningar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Testiklar

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Icke-apoptotiska kaspasaktivitet i Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...