Name: isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

نحن ممتنون للبروفيسور الفخري جان كلود Perriard وإيفلين Perriard (المعهد الاتحادي السويسري للتكنولوجيا، سويسرا) لإدخال تقنيات في عزلة عن الفئران حديثي الولادة والعضلية الماوس. نود أن نشكر الأستاذ جو تشن والبروفيسور سيلفيا إيفانز (جامعة كاليفورنيا سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية) لدعمهم. وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل لجنة نهر الميكونج EE الوظيفي مؤسسة غرانت. ويدعم SL قبل K99/R00 الطريق إلى جائزة الاستقلال من المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI (HL107744). وأيد TMM بواسطة زمالة ما بعد الدكتوراه من جمعية القلب الأمريكية (11POST7310066).

يصف الإجراء التالي ل16،17 بروتوكول لمدة يومين للعزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. كل الحلول هي معقمة أو معقمة تصفيتها. يتم تعقيم جميع الأدوات التي كتبها تعقيم السطح مع 75٪ من الإيثانول. باستثناء لاستخراج الأنسجة الأولية، يتم تنفيذ جميع الخطوات في العقيمة...

أصبح استخدام نماذج حيوانية لدراسة أمراض القلب القياسية في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية. توصيف البيوكيميائية أقرب من هذه النماذج (أي دراسة الاستجابات المباشرة للخلايا القلب للمؤثرات الكيميائية الحيوية أو النشاط الحيوي) وعادة ما يتطلب عزل أنسجة القلب أو ا...

أقرب تقارير عن التفكك ناجحة وثقافة خلايا القلب القوارض يعود تاريخها الى عام 1،2 في عام 1960. حتى ذلك الحين، لاحظت Harary وفارلي أن العضلية مثقف &quot;قد توفر نظاما فريدا لدراسة متطلبات انقباض الدوري [ويجوز] توفير وسيلة لتحديد مساهمة مختلف المسارات الأيضية لل[الضرب] العملية&quot;. على الرغم من Harary وفارلي العضلية معزولة ومثقف من صغار الفئران، والبروتوكول الأصلي قد تم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من العلماء على مر السنين، لم يتغير كثيرا من العزلة وزراعة الإجراء العام. ومع ذلك، والانزيمات أفضل 3 حلول موحدة 4،5، وإضافة قناة عكسها والميوسين أتباز المانع BDM لحماية الخلايا أثناء إجراء العزل 6-9 قد تحسنت بشكل ملحوظ الخلوي العائد والجدوى. الكبار مقابل cardiomyo حديثي الولادةcytes العضلية معزولة ومثقف من الفئران او الجرذان حديثي الولادة لديها العديد من المزايا ثقافات العضلية الكبار. قبل كل شيء، وإجراء العزل لحديثي الولادة الماوس أو الفئران القلوب هو أسهل وأقل تكلفة، إذا ما قورنت إلى عزل العضلية من الماوس الكبار أو الفئران 10. حديثي الولادة العضلية هي أقل حساسية بكثير لإعادة إلى المتوسطة التي تحتوي على الكالسيوم بعد التفكك، وزيادة كبيرة الخلوي العائد. ميزة كبيرة أخرى هي أن العضلية الماوس حديثي الولادة الخضوع لفقد التمايز أسرع - دورة عودة التمايز الذي ينتج عادة في ضرب الخلايا عفويا 20 ساعة بعد الطلاء، في حين تتطلب العضلية الكبار عادة للحث على سرعة الانكماش. العضلية حديثي الولادة هي أيضا أكثر بسهولة transfectable مع أساليب الليبوسومال ترنسفكأيشن، في حين العضلية الكبار تتطلب النواقل الفيروسية للتسليم ناجحة من الحمض النووي المعدل وراثيا. وعلى النقيض من cardiomyocyte حديثي الولادةق، ثقافة العضلية القوارض الكبار 11-13 يسمح للتحقيقات من تدهور myofibrillar وإعادة في نهاية المطاف من جهاز مقلص. هذه التغييرات شكلية متميزة في العضلية الكبار تحدث على مدى فترات من 1-2 أسابيع. ويرافق عودة التمايز من خلال دورة reexpression من البرنامج الجيني الجنين، وبالتالي محاكاة التغيرات المرضية التي لوحظت في الإنسان بعضلة القلب 14 - وفقد التمايز. ميزة أخرى من الفئران العضلية الكبار على ثقافة العضلية حديثي الولادة هو القدرة على ثقافة هذه الخلايا لفترات طويلة من الزمن. الفئران مقابل العضلية الماوس العزلة وثقافة العضلية الفئران حديثي الولادة لديها بعض الفوائد من خلال تلك الماوس العضلية حديثي الولادة، بما في ذلك عائدات أعلى من خلايا قابلة للحياة وزيادة معدلات ترنسفكأيشن. ومع ذلك، فإن استخدام واسعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لعلاج أمراض القلب (على سبيل المثال &lt;م /&gt; وليم العضلات بروتين بالضربة القاضية الماوس كنموذج للتمدد عضلة القلب 15) قد أدى إلى التكيف من إجراء العزل لالعضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة. على الرغم من أن البروتوكولات المستخدمة لعزل الجرذان والفئران حديثي الولادة العضلية هي متطابقة تقريبا، يجب توخي الحذر أكبر في اختيار مزيج انزيم المناسبة لهذا الأخير. في الواقع، العضلية الماوس حديثي الولادة عادة ما تكون أكثر عرضة للoverdigestion، مما أدى إلى انخفاض العائد الخلية وقدرتها على البقاء. علاوة على ذلك، ينبغي تعديل كثافة الطلاء، لأن العضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة هي أصغر نوعا ما مقارنة مع الخلايا المشتقة من قلوب الفئران حديثي الولادة. مع العديد من الاستخدامات للتحقيق في، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المعلمات الخلية البيولوجية والمورفولوجية النشاط الحيوي وكذلك لعملية myofibrillogenesis، أصبحت العضلية الولدان مثقف واحد من أكثر الأنظمة تنوعا لدراسةوظائف الخلية القلبية في المختبر. الخطوة الأولى لمقايسة ناجحة ومع ذلك، يعتمد على منهجية سهلة وموثوقة لعزل العضلية الماوس حديثي الولادة. بروتوكول لدينا توجه منهجيته من مصادر عديدة، وكان الأمثل لاستنساخ ومتانة. نناقش العوامل التي تؤثر cardiomyocyte الغلة وقدرتها على البقاء، وتوفير مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

لطالما استخدمت العضلية الولدان مثقف لدراسة myofibrillogenesis وظائف myofibrillar. العضلية مثقف تسمح للتحقيق سهلة والتلاعب من المسارات البيوكيميائية، وتأثيرها على خصائص النشاط الحيوي للضرب عفويا العضلية. يصف بروتوكول 2 يوما بعد العزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. وتبين لنا كيفية تشريح بسهولة قلوب من حديثي الولادة، فصل الأنسجة العضلية القلبية وإثراء من القلب خلية السكان. نناقش استخدام انزيم يمزج مختلفة لخلية التفكك، وآثارها على الخلية قدرتها على البقاء. والعضلية معزولة يمكن استخدامها في وقت لاحق لمجموعة متنوعة من المورفولوجية، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المقايسات خلية بيولوجية أو النشاط الحيوي. نحن الأمثل لبروتوكول لمتانة والتكاثر، باستخدام الحلول الوحيدة المتاحة تجاريا والتي تختلط انزيم SHآه القليل الكثير إلى الكثير تقلب. نحن أيضا معالجة المشاكل المشتركة المرتبطة العزلة وثقافة العضلية، وتوفر مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.

باستخدام هذا البروتوكول، ونحن عزل قلوب من 8 يوم واحد الفئران حديثي الولادة القديمة (أرقام 1A، 1B، خلفية فيلم S1). بعد الغسيل وتنميق قلوب مع مقص (أرقام 1C-1F)، ومهضوم شظايا الأنسجة في عزلة المتوسطة أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. بعد هضم مسبق <st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

الأولية الثقافات الماوس cardiomyocyte هي واحدة من الأدوات المحورية للتحقيق في منظمة myofibrillar وظيفة. يصف بروتوكول التالية العزلة وثقافة العضلية الأولية من قلوب الماوس حديثي الولادة. ويمكن استخدام الثقافات cardiomyocyte الناتجة لاحقا لمجموعة متنوعة من النشاط الحيوي، فحوصات البيوكيميائية وخلايا البيولوجية.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

العزلة وتسجيلات قناة كيلو فولت في الفئران Cardiomyocytes الأذيني البطيني و

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...