Name: isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Biz Prof fahri Jean-Claude Perriard ve Evelyn Perriard yenidoğan sıçan ve fare kardiyomiyosetlere izolasyon teknikleri içine giriş için (Teknoloji, İsviçre İsviçre Federal Enstitüsü) müteşekkiriz. Biz onların destek için Prof Ju Chen ve Prof Sylvia Evans (UCSD, ABD) teşekkür etmek istiyorum. EE laboratuvar İş MRC Kariyer kurulması Grant tarafından finanse edildi. SL NIH / enstitünün (HL107744) dan bağımsızlık ödül için K99/R00 yolu tarafından desteklenmektedir. TMM Amerikan Kalp Derneği (11POST7310066) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki prosedür, neonatal fare kardiyomiyositlerde izolasyonu ve kültürü için iki günlük bir protokol 16,17 açıklanmaktadır. Bütün çözeltiler, steril veya steril filtre edilmiş bulunmaktadır. Bütün araçlar% 75 etanol ile yüzey sterilizasyonu ile sterilize edilir. Ilk doku çıkarma hariç olmak üzere, tüm adımları steril bir laminer akış başlığı içinde bir hücre kültürü yapılmaktadır. Bu protokol, bir-iki çöp (ler) den neonatal fare kalpleri izolasyonu için tasarl...

Kalp hastalıklarının çalışma hayvan modellerin kullanımı Kardiyovasküler araştırmalarda standart haline gelmiştir. Bu modellerin yakından biyokimyasal karakterizasyonu (örneğin, biyokimyasal ya da biyo-mekanik uyarıcılara kalp hücrelerinin doğrudan yanıtları eğitim), genellikle kalp dokularının veya kardiyomiyositlerin izole edilmesini gerektirmektedir. Kalbin fizyolojik tepkileri araştıran çalışmalar ex vivo (örneğin 40 asetilkolin, ya da iskemi reperfüzyon s...

Kemirgen kalp hücrelerinin başarılı ayrışma ve kültürü için erken raporlarının 1960 1,2 dayanıyor. O zaman bile, Harary ve Farley kültürlü kardiyomiyositler &quot;periyodik kontraktilitenin gereksinimleri çalışma için benzersiz bir sistem sağlayabilir [ve olabilir] [dayak] işlemi için çeşitli metabolik yolların katkısını belirlemek için bir araç sağlamak&quot; olduğunu fark ettim. Genç farelerde ve özgün protokolden Harary ve Farley izole ve kültürlü kardiyomiyositler yılda uyarlanmış ve birçok bilim adamı tarafından değiştirilmiş olmasına rağmen, genel izolasyon ve kültür prosedür büyük ölçüde değişmedi. Ancak, daha iyi enzimler 3, standart çözeltiler 4,5, ve izolasyon prosedürü sırasında 6-9 hücreleri korumak için, tersinir kanal ve myosin ATPase inhibitörü BDM ilavesinin anlamlı hücre verimi ve canlılığı geliştirdi. Yenidoğan cardiomyo vs Adultcytes Neonatal fare veya sıçan izole edilmiş ve kültürlenmiş Kardiyomiyositler yetişkin kardiyomiyositlerde kültürler üzerinde çeşitli avantajları vardır. Yetişkin fare veya sıçanın 10 kardiyomiyositlerin izolasyonu kıyasla önemlisi, yenidoğan fare veya sıçan kalpleri için izolasyon prosedürü, daha kolay ve daha az maliyetlidir. Neonatal kardiyomiyositlerde büyük hücre verimini artırmak, ayrışma sonra bir kalsiyum-içeren bir ortam içine tekrar başlatmak için çok daha az duyarlıdır. Yetişkin kardiyomiyositler genellikle kasılmasını uyardığı volta ihtiyaç duyarken, genellikle kendiliğinden kaplamadan sonra hücreler 20 saat yenerek sonuçları Rediferansiasyon döngüsü - Başka bir büyük avantajı yenidoğan fare kardiyomiyositler daha hızlı farksızlaşma tabi olmasıdır. Yetişkin kardiyomiyositlerde transgenik DNA&#39;nın başarılı gönderim viral vektörler gerektirir ise Neonatal kardiyomiyositlerde, hali hazırda daha da lipozomal transfeksiyon yöntemleri ile transfekte bulunmaktadır. Neonatal kardiyomiyosit aksines, yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerinin 11-13 kültür miyofibriler bozulması ve kontraktil aparat nihai yeniden kurulması soruşturma için izin verir. Yetişkin kardiomyositlerindeki Bu karakteristik morfolojik değişiklikler, 1-2 haftalık dönemlerde ortaya çıkar. Farksızlaşma - Rediferansiasyon döngüsü böylece insan kardiyomiyopati 14 gözlenen patolojik değişikliklerin taklit eden, fetal gen program reexpression eşlik eder. Neonatal kardiyomiyositlerin kültürüne de yetişkin fare kardiyomiyositlerin diğer bir avantajı, uzun bir süre boyunca kültüre yeteneği, bu hücredir. Fare kardiyomiyositler vs sıçan Sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü canlı hücrelerin daha yüksek verim ve artan transfeksiyon oranları dahil olmak üzere mouse yenidoğan kardiyomiyositlerinin, o üzerinde bazı faydaları vardır. Ancak, kardiyak hastalıklar için genetiği değiştirilmiş fare modellerinin geniş kullanım (örn. &lt;/ Em&gt; dilate kardiyomiyopati 15 için bir model olarak kas lim protein knockout fare) neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerin için izolasyon prosedürü uyarlanmasına yol açmıştır. Neonatal sıçan ve fare kardiyomiyositlerde izole edilmesi için kullanılan protokoller hemen hemen aynı olmasına rağmen, daha büyük bir bakım ikincisi için uygun bir enzim karışımı seçiminde dikkate alınmalıdır. Gerçekten de, neonatal fare kardiyomiyositlerde azaltılmış verim ve hücre canlılığı ile sonuçlanan genel olarak Overdigestion karşı daha hassastır. Neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerde yenidoğan sıçan kalplerinde türetilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında biraz daha küçük olduğu için Ayrıca, kaplama yoğunluğu, ayarlanmalıdır. Morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ve biyomekanik parametreleri hem de myofibrillogenesis süreci için araştırılması için bir çok kullanıma sahip, kültürlü neonatal kardiyomiyositlerde çalışma için çok yönlü sistemlerinden biri haline gelmiştirin vitro kardiyak hücre fonksiyonları. Başarılı bir tahlil için ilk adım, ancak, neonatal fare kardiyomiyositlerde izole etmek için kolay ve güvenilir bir yöntem bağlıdır. Bizim protokol birçok kaynaktan metodolojisini çizer ve tekrarlanabilirlik ve sağlamlık için optimize edilmiştir. Biz kardiyomyosit-verim ve canlılığını etkileyen faktörleri tartışmak ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

Kültürlü neonatal kardiyomiyositler uzun myofibrillogenesis ve miyofibriler fonksiyonlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Kültürlü kardiyomiyositler kolay soruşturma ve manipülasyon biyokimyasal yolların ve kendiliğinden kardiyomiyositlerin dayak biyomekanik özellikleri üzerine etkileri için izin verir. Aşağıdaki 2 günlük protokol neonatal fare kardiyomiyositlerin izolasyonunu ve kültür açıklar. Biz kolayca yenidoğanlardan kalpleri incelemek kardiyak doku ayırmak ve kardiyak hücre-nüfustan kardiyomiyositlerin zenginleştirmek için nasıl göstereceğim. Bu hücre ayrışması için farklı bir enzim karışımlarının kullanımı, ve hücre canlılığı üzerindeki etkilerini tartışır. İzole edilmiş kardiyomiyositlerde sonra morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ya da biyo-mekanik bir çok analizde kullanılabilir. Biz sadece piyasada mevcut çözümlerini kullanarak, sağlamlık ve tekrarlanabilirlik için protokol optimize edilmiş ve enzim karışır show az lot partiye değişkenlik. Biz de kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü ile ilgili ortak sorunları çözmek ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunuyoruz.

Bu protokolü kullanarak, 8 bir gün eski yenidoğan farelerin (Şekil 1A, 1B, Ek Film S1) kalplerini izole. Yıkama ve makas (Şekil 1 C-1F) ile kalpleri kıyma işleminden sonra doku fragmanları, yumuşak çalkalama ile 4 ° C&#39;de gece boyunca izolasyon ortamı içinde önceden sindirilmiş edilmiştir. Predigestion (Şekil 1G) takiben, taze ortam içine sindirim doku parçaları transfer ve nazik çalkalama ile 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca doku parçaları in...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biyoloji

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...