Name: establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

الكتاب أود أن أشكر اليزابيث بلانشارد للحصول على المساعدة الفنية لها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

<ol>
	<li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li><li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro.">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li><li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier.">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li><li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers.">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li><li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides.">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li><li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells.">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li><li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+(hpIgR).">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li><li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium.">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li><li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence.">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li><li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide.">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+(SARS)+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection.">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729 (2010).</li><li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection.">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947 (2012).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li><li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized,+specific+to+ciliated+cells,+and+without+obvious+cytopathology.">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li><li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles:+a+preliminary+study.">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li><li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

عند إنشاء Calu-3 LCC في إدراج Transwell، قد لا خلايا استقطاب في كل شيء، أو لا استقطاب بالكامل، كما تم تعريفها من قبل طير ≥ Ω × 1000 سم 2 و≤ 1٪ موازنة الصوديوم فلوريسئين صبغ بين حجرات قمية وbasolateral. وبالإضافة إلى ذلك، قد Calu-3 خلايا في استقطاب LCC تماما، ولكن قد تكون غير متناسقة طير بين القياسات. على الرغم من التقلبات في القياسات طير من Calu-3 LCC طبيعية من يوم لآخر، ومن غير المتوقع تماما مرة واحدة الاستقطاب، وتقلب كبير في طير حتى ينخفض ​​بشكل طبيعي ثقافة مع التقدم في السن، والتي قد تكون اقل من 5 أسابيع أو ما دامت 12 أسبوعا بعد البذر. قدرة Calu-3 LCC لاستقطاب يعتمد في جزء منه على كيفية الحفاظ على الخلايا وsubcultured قبل الاستخدام في نظام Transwell. الخلايا التي نمت خارج التقاء 90٪ وأحادي الطبقة خلال subculturing، التي تم subcultured أكثر من 10 مرات من المخزون المجمدة، أو التي لا تكونEN المتوفرة مع الطازجة المتوسطة على جدول منتظم هم أقل عرضة للاستقطاب بالكامل، والاستقطاب أي من المرجح أن ينخفض ​​بسرعة. ويمكن أيضا عدم ناقصة أو الكلي من الاستقطاب يمكن أن يعزى إلى اختلاف في حجم المسام والمواد من Transwells تستخدم لCalu LCC-3، وإلى الكثير الكثير من التباين في تركيبة مماثلة Transwells وحجم المسام قد تؤثر أيضا الاستقطاب. يمكن أحجام أكبر المسام تسمح Calu-3 في النمو من خلال الغشاء Transwell في مقصورة basolateral، ومنع الثقافة من الاستقطاب. وأشار إلى عدم وجود الاستقطاب قد يكون أيضا بسبب نمو البكتيريا، من خلال ثقافة المتوسط ​​بظلالها، مما يؤدي إلى انهيار اللاحقة للمنعطفات ضيقة بين الخلايا Calu-3. قد يكون سبب القياسات طير متغير من Calu-3 LCC عن اضطرابات الميكانيكية للmonolayers Calu-3 خلية LCC، إدراج، أو لوحات أنفسهم. يجب أن يتم تنفيذ التغييرات والقياسات المتوسطة طير بدون نصائح أو ماصة الكهربائيةدي يؤدي لمس الخلايا. أثناء تنفيذ هذه العمليات، ينبغي الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى حجرات قمية وbasolateral، والتي سوف تعطيل قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة. قد يقتصر أيضا على قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة في ثقافة الاستقطاب التي هي في الواقع من تراكم البروتين يؤدي على القطب. قد تتم إزالة هذا تراكم مع طيف الرملي، أو قد يتم تصحيحها عن طريق الاستعاضة عن القطب. مرة واحدة Calu-3 LCC استقطاب تماما وطير في تزايد لم يعد، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها كعامل في المختبر نموذج لوصف ردود المضيف الرئة الخلايا الظهارية لعدوى الجهاز التنفسي. هذا النظام يسمح أفضل توصيف الردود الاتجاه لمسببات الأمراض مقارنة أحادي الطبقة، خطوط الخلايا المستزرعة الرئة تستخدم عادة لدراسة مسببات الأمراض التنفسية، مثل التهاب الكبد وخلايا A549-2، مع مزايا إضافية من Calu-3 باي LCCنانوغرام أسرع لتطوير وبسهولة أكبر الحصول عليها، وأقل تكلفة لتوليد من الابتدائي، NHBE، الاستقطاب متباينة. مماثلة لNHBE، الاستقطاب Calu-3 إثبات مشددة تشكيل تقاطع، وإنتاج mucins. ولكن، خلافا NHBE، الاستقطاب Calu-3 خلايا لا تفرق في طبقات من الخلايا القاعدية والخلايا المهدبة العمودية الطلائية، وعدد قليل الاستقطاب Calu-3-أهداب الخلايا تطوير مثل التوقعات 19. وهكذا، على الرغم من المفيد لدراسة الردود الاستقطاب من الخلايا الظهارية الهوائية لإهانة الجهاز التنفسي، والاستقطاب Calu-3 LCC ليست نموذجا مثاليا لدراسة التنمية مجرى الهواء أو إعادة عرض ردا على إهانة أو إصابة الجهاز التنفسي. قد إنتاج المخاط من قبل الخلايا المستزرعة في المختبر تؤثر العدوى الخلوية، وكذلك الإفراج عن فيروس المعدية وانتشار الفيروس في نموذج الاستقطاب، وإجراء مقارنة مباشرة للإنتاج المخاط بين الاستقطاب LCC-3 Calu ولم تبلغ الاستقطاب، NHBE متباينة تم . A549 والخلايا التهاب الكبد A-2إعادة أسهل للثقافة من الخلايا-3 Calu، ولكن، خلافا Calu-3 LCC، فإنها لا تشكل الثقافات الاستقطاب عندما نمت على إدراج Transwell، وبالتالي هي نماذج مثالية لا لفحص في المختبر ردود الخلايا الظهارية المستقطبة لعدوى فيروس الجهاز التنفسي .

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0،05٪ التربسين - EDTA 0.02٪ </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> النسر متوسطة الأساسية الدنيا (EMEM) </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> حرارة تعطيل، 56 ° C، 30 دقيقة </td></tr><tr><td> غير الضرورية الأحماض الأمينية 100X (10 ملم) </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 11140 </td><td> متجر في C ° 4 في الظلام </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10٪ FBS (EMEM-10٪) </td><td></td><td></td><td> تكملة EMEM مع FBS المعطل للحرارة إلى 10٪ مصل، مرشح العقيمة </td></tr><tr><td> EMEM-20٪ FBS + ملاحق (EMEM-20٪ + S) </td><td></td><td></td><td> تكملة EMEM لتركيزات النهائي: FBS المعطل للحرارة بنسبة 20٪ 1X الأحماض الأمينية؛ 2 مم L-الجلوتامين؛ HEPES ملي 10؛ العقيمة مرشح </td></tr><tr><td> 24-وحات جيدة Transwell </td><td> كورنينج COSTAR </td><td> 3472 </td><td> 3 المساحة المسام ميكرومتر، والبوليستر </td></tr><tr><td> التريبان الأزرق </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> سيجما </td><td> E7023 </td><td> إعداد إلى 70٪ باستخدام معقم DH 2 O </td></tr><tr><td> Dulbecco في PBS (D-PBS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> غير الفلورسنت العازلة </td><td></td><td></td><td> 118 مم كلوريد الصوديوم؛4،75 بوكل مم؛ 2.53 ملي CaCl 2 × H 2 O؛ 2،44 ملم MgSO 4؛ 1،19 ملم KH 2 PO 4؛ 25 مم NaHCO 3 في الماء المعقم؛ العقيمة مرشح </td></tr><tr><td> الصوديوم فلوريسئين </td><td> سيجما </td><td> 6377 </td><td> 1 ملغ / مل في المخزن المؤقت غير معقمة الفلورية؛ العقيمة مرشح، بعيدا عن الضوء؛ المحل في 4 درجات مئوية تصل إلى 6 أشهر </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 الكهربائي </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA لوحة قارئ </td><td></td><td></td><td> قادرة على قياس 486 أو 490 A A </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

السطوح قمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الهوائية تظهر الاستجابات الاتجاه إلى التعرض الممرض في الجسم الحي. وهكذا، مثالية نماذج في المختبر لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض التنفسية استقطاب، وتشكيل السطوح قمية وbasolateral. ويتمايز نموذج واحد مثل الإنسان الطبيعي الخلايا الظهارية القصبية (NHBE). ومع ذلك، فإن هذا النظام يتطلب عينات أنسجة الرئة والخبرات وعزل الخلايا الظهارية زراعة الأنسجة من، والوقت لإنشاء واجهة الثقافة الهواء السائل. Calu-3 خلايا، والمستمدة من الشعب الهوائية والسرطان الغدي الإنسان، هي النموذج البديل للنظر في استجابة الخلايا الظهارية الهوائية القريبة لإهانة الجهاز التنفسي 1، مركبات الدوائية 2-6 و 7-9 والبكتيرية والفيروسية مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس الأنفلونزا، فيروسات الانف والمتلازمة التنفسية الحادة - المرتبطة التاجى 10-14. مؤخرا، ثأظهرت الإلكتروني التي Calu-3 خلايا عرضة لفيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV) في العدوى على نحو يتفق مع NHBE 15،16. هنا، ونحن من التفصيل إرساء ثقافة الاستقطاب السائل المغطاة، (LCC) من الخلايا-3 Calu، مع التركيز على التفاصيل التقنية لزراعة الخلايا والنمو Calu-3، والحفاظ على الخلايا التي تم زرعها في LCC، ونقدم الأسلوب لتنفيذ عدوى فيروس الجهاز التنفسي من الاستقطاب خلايا-3 Calu. للحصول على الاستقطاب باستمرار Calu LCC-3، Calu-3 يجب خلايا subcultured بعناية قبل زراعة في إدراج Transwell. يجب Calu-3 الثقافات أحادي الطبقة تظل دون التقاء 90٪، وينبغي subcultured أقل من 10 مرات من المخزون المجمدة، ويجب أن يتم توفير بانتظام مع المتوسط ​​الطازجة. مثقف مرة واحدة في Transwells، لا بد من التعامل معها Calu-3 LCC بعناية. عدم انتظام وسائل الإعلام وتعطيل التغييرات الميكانيكية أو المادية للطبقات الخلية أو لوحات تؤثر سلبا الاستقطاب للعدة ساعات أو أيام. ويتم رصد الاستقطاب من خلال تقييم عبر الظهارية المقاومة الكهربائية (طير) ويتم التحقق من خلال تقييم السلبي للموازنة الصوديوم فلوريسئين بين حجرات قمية وbasolateral 17،18. الهضاب طير مرة واحدة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض في الجهاز التنفسي.

عندما نمت وسائل المغطاة الثقافات (LCC) في نظم الثقافة Transwell، كما هو موضح في الشكل 1، Calu-3 خلايا استقطاب وتطوير متميزة السطوح قمية وbasolateral. وفقا للطريقة الموصوفة هنا، المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (طير) من Calu LCC-3 تصل إلى الهضبة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω في غضون 3 أسابيع بعد الغرس ومثال الذي يظهر في الشكل 2. وشكلت منعطفات ضيقة بين الخلايا الاستقطاب السلبي موازنة منع من جزيئات صغيرة بين حجرات قمية وbasolateral. وبالتالي، يتم استخدام فلوريسئين الصوديوم تعديل موازنة فحص للتأكد من الاستقطاب Calu-3 LCC 15،17،18. كما طير من monolayers الخلية Calu-3 في زيادات LCC، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates بشكل سلبي في مقصورة basolateral النقصان. مرة واحدة في طير هو 1،000 × Ω سم 2، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates في<html> إلى المقصورة basolateral و≤ 1٪، كما هو موضح في الشكل 3، وبالتالي، تعتبر Calu-3 LCC أن تكون مستقطبة بشكل كامل عندما هو طير ≥ Ω × 1000 سم 2. قد طير قياس ذروة Calu-3 LCC تختلف من تجربة إلى تجربة. ومع ذلك، مرة واحدة هضبة القيم طير لأي تجربة معينة، قد، غير مصاب تماما الاستقطاب Calu-3 LCC تكون مستقرة لمدة 5 إلى 12 أسابيع بعد البذر. قد يكون سبب غياب التنمية المقاومة في Transwell-مثقف Calu-3 من قبل عدة عوامل على النحو المبين في الجدول 1. مرة واحدة في طير من Calu-3 الهضاب LCC عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، هذا النموذج هو على استعداد لاستخدامها لفحص ردود الخلايا الظهارية الهوائية لمسببات الأمراض التنفسية، بما في ذلك فيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV). التعرض لنتائج RSV في انخفاض أسرع في نزاهة ثقافة الاستقطاب مقارنة العدوى وهمية من الخلايا (الشكل 4). = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig1.jpg" /> الشكل 1. تزرع الخلايا المقطع العرضي تمثيل Transwell-مثقف الخلايا. على سطح الغشاء القمي إدراج. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> الشكل 2. التنمية العابرة للالظهارية المقاومة الكهربائية (طير) واستقطاب Calu-3 الخلايا بعد البذر في إدراج Transwell. وفي كل نقطة الوقت، كما يتم تقديم طير متوسط ​​سم × Ω ± 2 SEM من 32 بئرا مستقلة عن التجربة ممثل واحد. <img alt="الشكل 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> الشكل 3. السلبي equili<html> هو تحول دون bration من فلوريسئين الصوديوم في مقصورة basolateral من monolayers الخلية Calu-3 كما تصبح الخلايا الاستقطاب. يتم تقديم البيانات التراكمية من أربع تجارب مستقلة. كل نقطة بيانات يمثل القياس الفردية. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> الشكل 4. RSV إصابة LCC Calu-3 الاستقطاب تسارع انخفاض في سلامة أحادي الطبقة. المستقطب Calu-3 خلايا والمصابين RSV-A2 في وزارة الداخلية 1 = في يوم 0، وتمت مراقبة القطبية لمدة 8 أسابيع بعد العدوى. ويرد ممثل تجربة واحدة. يتم عرض البيانات في مقاومة متوسط ​​من 8 آبار مستقلة في الإصابة ± SEM في نقطة زمنية. * P &lt;0.05 بين الثقافات وهمية وRSV-A2 المصابين، على النحو الذي يحدده للطالب اختبار t. طرق &quot;&gt; <tbody><tr><td> قضية </td><td> القرار (ق) </td></tr><tr><td> المقاومة ليست قابلة للقياس </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي فقاعات الهواء في الآبار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا Calu-3 التي تم subcultured من المخزون المجمدة أقل من 10 مرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسمح Calu-3 خلايا لتصل إلى 100٪ في التقاء ثقافة فرعية أحادي الطبقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الخلايا لا تنمو على البلاستيك أقل بكثير من إدراج (تشير إلى أن الخلايا قد نمت من خلال مسام إدراج) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح 2-3 أسابيع بعد الغرس من أجل التنمية الكاملة المقاومة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من تكوين وحجم المسام من إدراج المستخدمة، تغيير إذا لزم الأمر (مستحسن إدراج البوليستر، 0.3 ميكرون حجم المسام، لا الطلاء، انظر المواد للحصول على التفاصيل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من جودة القطب، الرملي بلطف لإزالة البروتينات المتراكمة من طرف، واستبدال إذا لزم الأمر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق المتوسطة لنمو البكتيريا </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> المقاومة تتطور، ولكن لم يبلغوا الاستقطاب الكامل (≥ Ω × 1000 سم 2) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إتاحة المزيد من الوقت لاستقطاب لتطوير (قد تتخذ في بعض الأحيان تصل إلى 4 أسابيع) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا Calu-3 التي تم subcultured من المخزون المجمدة أقل من 10 مرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسمح Calu-3 خلايا لتصل إلى 100٪ في التقاء ثقافة فرعية أحادي الطبقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال باستمرار المتوسطة في الثقافات Transwell، بالتناوب بين النهار والثالثة والرابعة ثم بعد الرضاعة السابقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا فقط على إدراج الثقافة التي يتم وضعها في الصفوف الخارجي للوحات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكثير مختلفة من إدراج Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> خلايا استقطاب تماما، ولكن المقاومة ليست متسقة من قراءة واحدة إلى أخرى </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تعطيل أو كومة لوحات في الحاضنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسبب الاهتزاز في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية في حين Transwell بلاتويجري التعامل معها ES </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي فقاعات الهواء في الآبار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تخل طبقة الخلايا مع نصائح ماصة عند تغيير أداء وسائل الإعلام أو قراءات طير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم الانسان 200 ميكرولتر المتوسطة في المقصورة القمي، وانخفاض الصوت قد يؤدي إلى قراءات غير مستقرة طير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من جودة القطب، الرملي بلطف لإزالة البروتينات المتراكمة من طرف، واستبدالها إذا لزم الأمر </li></ul></td></tr></tbody></table> الجدول 1. حل المشاكل التي قد تنشأ المشاكل عندما زراعة الخلايا Calu-3 في Transwells. عوامل متعددة تسهم في استقطاب كاملة من خلايا-3 Calu في السائل المغطاة الثقافات، وعلى الأرجح من التي أبرزت في هذا الجدول.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

تطوير اللعابية الأجسام المضادة المناعية المتعددة لقياس التعرض البشري للمسببات البيئية

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...