Name: establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

המחברים מבקשים להודות לאליזבת Blanchard לקבלת הסיוע הטכני שלה. הממצאים והמסקנות בדו&quot;ח זה הם של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.

<ol>
	<li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li><li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro.">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li><li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier.">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li><li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers.">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li><li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides.">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li><li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells.">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li><li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+(hpIgR).">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li><li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium.">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li><li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence.">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li><li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide.">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+(SARS)+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection.">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729 (2010).</li><li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection.">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947 (2012).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li><li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized,+specific+to+ciliated+cells,+and+without+obvious+cytopathology.">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li><li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles:+a+preliminary+study.">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li><li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כאשר הקמת Calu-3 LCC במוסיף Transwell, תאים לא יכולים לקטב בכלל, או לא יכולים לקטב באופן מלא, כפי שהוגדרו על ידי TEER ≥ Ω 1000 × 2 סנטימטר ו≤ 1% איזון צבע נתרן fluorescein בין תאי apical וbasolateral. בנוסף, Calu 3 תאים בLCC יכולים לקטב באופן מלא, אך עשויה להיות לא עקבי TEER בין מדידות. למרות תנודות במדידות TEER של Calu-3 LCC הן נורמליות מיום ליום, נדנדות פעם מקוטבות באופן מלא, דרמטיות בTEER לא צפויות עד שהתרבות באופן טבעי יורדת עם גיל, שיכול להיות קטן כמו 5 שבועות או כל עוד 12 שבועות לאחר זריעה. היכולת של Calu-3 LCC לקטב תלויה בחלקו על אופן בו תאים נשמרים וsubcultured לפני השימוש במערכת Transwell. תאים שצמחו מעבר למפגש 90% כmonolayer במהלך subculturing, כי כבר subcultured יותר מ 10 פעמים מהמניות קפוא, או שלא תהיהen מסופק עם מדיום טרי על לוח זמנים קבוע נוטה פחות לקטב באופן מלא, וכל קיטוב צפוי לרדת במהירות. חוסר חלקי או מלאה של קיטוב גם ניתן לייחס לשינויים בחומר והגודל נקבובי של Transwells משמש לCalu-3 LCC, ושונות הרבה להרבה בTranswells של הרכב דומה וגודל נקבובי עשויות להשפיע גם על קיטוב. נקבוביים בגדלים גדולים יותר יכולים לאפשר Calu-3 לצמוח דרך קרום Transwell לתוך תא basolateral, מניעת התרבות מקיטוב. העדר הקיטוב יכול להיות גם בשל התפתחות חיידקים, שצוין על ידי תרבות בינונית מעורפלת, מה שמוביל להתמוטטות הבאה של צומת ההדוקים בין 3 Calu תאים. מדידות TEER משתנות של Calu-3 LCC עלולות להיגרם על ידי הפרעות מכאניות של monolayers Calu -3 LCC התא, מוסיף, או את הצלחות בעצמם. שינויים בינוניים ומדידות TEER צריכים להתבצע בלי עצות פיפטה או אלקטרודה מובילה לגעת בתאים. בעת ביצוע פעולות אלה, יש להקפיד להימנע מהחדרת בועות אוויר אל תאי apical וbasolateral, אשר משבשים את היכולת של voltohmmeter לזהות התנגדות. היכולת של voltohmmeter לזהות התנגדות בתרבות שהיא למעשה מקוטב יכולה גם מוגבלת על ידי הצטברות חלבון על מוביל אלקטרודות. למעלה לבנות זה עשוי להסיר עם משייף עדין, או ניתן לתקן על ידי החלפת אלקטרודה. ברגע Calu-3 LCC לקטב לחלוטין וTEER כבר לא עולה, Calu-3 LCC מוכן לשימוש כמודל במבחנה לאפיון תגובות תא אפיתל ריאה מארחת לזיהום בדרך נשימה. מערכת זו מאפשרת אפיון טוב יותר של תגובות כיוונית לפתוגנים השוואה לשורות תאי ריאת monolayer-תרבית משמשות באופן מסורתי כדי ללמוד פתוגנים בדרכי נשימה, כגון A549-2 והפ תאים, עם יתרונות הנוספים של Calu-3 LCC being מהיר יותר לפיתוח, המתקבל בקלות רבה יותר, ופחות יקר להפקה מאשר NHBE הראשוני, מקוטב, מובחן. בדומה לNHBE, מקוטב Calu-3 להפגין היווצרות צומת הדוקה, ולייצר mucins. עם זאת, בניגוד לNHBE, Calu-3 תאים מקוטבים אינם מבחין לתוך שכבות של תאי בסיס ותאי אפיתל ריסי columnar, וCalu-3 כמה תאים מקוטבים לפתח תחזיות ריסים כמו 19. כך, למרות ששימושי לבחינת תגובות מקוטבות של תאי האפיתל בדרכי אוויר לנשימת עלבון, Calu-3 המקוטבים LCC הוא לא מודל אידיאלי לבדיקת פיתוח דרכי נשימה או שיפוץ בתגובה לעלבון או פגיעה בדרכי נשימה. ייצור ריר על ידי תאים בתרבית במבחנה עשוי להשפיע infectivity סלולרי, כמו גם שחרורו של וירוס מדבק והתפשטות וירוס במודל מקוטב, והשוואה ישירה בין ייצור הריר Calu-3 המקוטבים LCC וNHBE מקוטב, בדיל לא דווח . A549 ו- 2 תאים HEPמחדש קל יותר לתרבות מאשר-3 Calu תאים, עם זאת, שלא כמו Calu-3 LCC, הם לא יוצרים תרבויות מקוטבות כאשר גדלו במוסיף Transwell, ובכך מהווים מודל אידיאלי לבדיקה לא במבחנה את התגובות של תאי האפיתל מקוטבים לזיהום וירוס בדרך נשימה .

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין 0.05% - 0.02% EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> הבינוני החיוני המינימאלי של הנשר (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> חום להשבית, 56 ° C, 30 דקות </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות 100x (10 מ&quot;מ) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> חנות ב 4 ° C בחושך </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10% FBS (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> תוספת EMEM עם FBS חום מומת עד 10% בסרום, עקר מסנן </td></tr><tr><td> EMEM-20% FBS + תוספים (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> תוספת EMEM לריכוזים סופיים: FBS חום מומת, 20%; 1X חומצות אמינו; 2 L-גלוטמין מ&quot;מ; 10 HEPES מ&quot;מ; עקר מסנן </td></tr><tr><td> צלחות Transwell 24 גם </td><td> קורנינג שחקן משנה </td><td> 3472 </td><td> 3 גודל נקבובי מיקרומטר, פוליאסטר </td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> סיגמא </td><td> E7023 </td><td> הכן ל 70% באמצעות DH 2 O סטרילי </td></tr><tr><td> PBS של Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ ללא ניאון </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2.44 mM MgSO 4; 1.19 mM KH 2 PO 4, 25 מ&quot;מ 3 NaHCO במים סטריליים; עקר מסנן </td></tr><tr><td> fluorescein נתרן </td><td> סיגמא </td><td> 6377 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בחיץ סטרילי שאינו ניאון; עקר מסנן, להגן מפני אור; חנות ב 4 ° C עד 6 חודשים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 האלקטרודה </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA צלחת קורא </td><td></td><td></td><td> מסוגל למדוד 486 או 490 </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

משטחי apical וbasolateral של תאי האפיתל של דרך נשימה להפגין תגובות כיוונית לחשיפת הפתוגן בגוף חי. לפיכך, אידיאלי במודלים חוץ גופייה לבחינת תגובות תאיות לפתוגנים נשימה לקטב, ויצר משטחי apical וbasolateral. מודל אחד כזה הוא מובחן תאים נורמלים אדם סימפונות אפיתל (NHBE). עם זאת, מערכת זו דורשת דגימות רקמת ריאה, מומחיות ובידוד תאי האפיתל culturing מרקמות, וזמן כדי ליצור תרבות ממשק אוויר נוזלית. -3 Calu תאים, הנגזרים מאדנוקרצינומה סימפונות אנושיות, הם מודל חלופי לבחינת התגובה של תאי האפיתל של דרך נשימה הפרוקסימלי לעלבון נשימה 1, תרכובות תרופתיות 2-6, ו7-9 חיידקים ופתוגנים נגיפיים, כוללים וירוס שפעת, rhinovirus ותסמונת חמורה נשימתית חריפה - המשויכת קורונה 10-14. לאחרונה, Wהדואר הוכיח ש- 3 Calu תאים רגישים לוירוס בדרך נשימת סינסיציאלי (RSV) זיהום באופן עקבי עם NHBE 15,16. הנה, אנחנו פירוט הקמת התרבות המקוטבת, נוזל מכוסה (LCC) של-3 Calu תאים, תוך התמקדות בפרטים הטכניים של גידול ו- 3 Calu תאי culturing, שמירה על תאים שתרבית לLCC, ואנו מציגים את שיטה לביצוע זיהום וירוס בדרך נשימה של-3 Calu תאים מקוטבים. עקביות להשיג Calu-3 מקוטב LCC, Calu-3 תאים יש subcultured בקפידה לפני culturing במוסיף Transwell. Calu 3-תרבויות monolayer צריכות להישאר מתחת למפגש 90%, יש subcultured פחות מ 10 פעמים ממניות קפוא, וצריכים להיות מסופקות באופן סדיר עם מדיום חדש. תרבית לאחר בTranswells, Calu-3 LCC חייב להיות מטופל בזהירות. שינויים בתקשורת לא סדירים והגבלה מכאנית או פיזית של שכבות תאים או צלחות להשפיע לרעה על קיטוב עבורכמה שעות או ימים. קיטוב הוא פיקוח על ידי הערכת התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (TEER) ומאומת על ידי הערכת האיזון הפסיבי של fluorescein נתרן בין תאי apical וbasolateral 17,18. המישורים לאחר TEER או מעל 1000 Ω × 2 סנטימטר, Calu-3 LCC מוכנים להשתמש כדי לבחון תגובות תאיות לפתוגנים בדרכי נשימה.

כשגדל כתרבויות נוזליות מכוסות (LCC) במערכות תרבות Transwell, כפי שמודגם באיור 1,-3 Calu תאים לקטב, פיתוח משטחי apical וbasolateral מובחנים. בעקבות שיטה המתוארת כאן, התנגדות החוצה אפיתל החשמלית (TEER) של Calu-3 LCC מגיעה לרמה או מעל 1000 Ω × 2 סנטימטר תוך 3 שבועות לאחר זריעה, דוגמה שמוצגת באיור 2. צומת ההדוקים שנוצרו בין תאים מקוטבים למנוע איזון פסיבי של מולקולות קטנות בין תאי apical וbasolateral. לפיכך, בדיקת איזון fluorescein נתרן שונה משמשת כדי לאשר את הקיטוב של Calu-3 LCC 15,17,18. כTEER של Calu-3 monolayers הסלולרי בעליות LCC, כמות שfluorescein פסיבי equilibrates לתוך תא basolateral פוחתת. ברגע TEER הוא 1,000 Ω × 2 סנטימטר, כמות fluorescein שequilibrates ב<html> לתא basolateral הוא ≤ 1%, כפי שמוצגים באיור 3, ולכן Calu-3 LCC נחשבים למקוטב באופן מלא כאשר TEER הוא ≥ Ω 1000 × 2 סנטימטר. מדידת TEER השיא של Calu-3 LCC עשויה להשתנות מניסוי לניסוי. עם זאת, ברגע שרמת ערכי TEER לכל ניסוי נתון, מקוטב באופן מלא, אינו נגוע Calu-3 LCC עשוי להיות יציב במשך 5 עד 12 שבועות לאחר זריעה. העדר פיתוח התנגדות בTranswell-מתורבתים Calu-3 עשוי להיגרם על ידי מספר גורמים כמפורטים בטבלה 1. רגע TEER מישורי Calu-3 LCC או מעל 1000 Ω × 2 סנטימטר, המודל מוכן לשמש לבדיקה תגובות נשימת אפיתל תאים לפתוגנים בדרכי נשימה, כולל וירוס סינסיציאלי נשימה (RSV). חשיפה לתוצאות RSV בירידה מהירה יותר בשלמות התרבות מקוטבת בהשוואה לזיהום מדומה של תאים (איור 4). = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig1.jpg" /> איור 1. ייצוג חתך של תאי Transwell-תרבית. תאים גדלים על משטח הפסגה של הקרום להוסיף. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> איור 2. התפתחות של עמידות טרנס אפיתל החשמלי (TEER) וקיטוב של Calu-3 תאים לאחר זריעה במוסיפה Transwell. בכל נקודת זמן, TEER מוצגת כΩ x סנטימטר חציון 2 ± SEM של 32 בארות עצמאיות מניסוי נציג אחד. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> איור 3. הפסיבי equili<html> bration של fluorescein נתרן לתוך תא basolateral של Calu-3 monolayers הסלולרי מעוכב כתאים הופכים מקוטבים. נתונים מצטברים מארבעה ניסויים העצמאיים הוא מוצג. כל נקודת נתונים מייצגים מדידה בודדה. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> איור 4. זיהום RSV של Calu-3 LCC המקוטב מאיץ ירידה בשלמות monolayer. Calu-3 תאים מקוטבים היו נגוע בRSV-A2 במשרד פנים = 1 ביום 0, והקוטביות הייתה פיקוח במשך 8 שבועות לאחר הדבקה. ניסוי נציג אחד מוצג. נתונים מוצגים כהתנגדות ממוצעת של 8 בארות עצמאיות לזיהום ± SEM כל נקודת זמן. * P &lt;0.05 בין תרבויות חיקוי ו- A2 הנגועות-RSV, כפי שנקבעו על ידי מבחן t של סטודנט. דרכים &quot;&gt; <tbody><tr><td> גיליון </td><td> רזולוציה (ים) </td></tr><tr><td> התנגדות אינה מדידה </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל בועות אוויר בבארות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש-3 Calu תאים שsubcultured ממניות קפוא פחות מ 10 פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשרו ל- 3 Calu תאים להגיע למפגש 100% בתת monolayer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו שתאים אינם גדלו על הפלסטיק הרבה מתחת להוסיף (המציין כי תאים עשויים שגדלו דרך הנקבובי של ההוספה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעבור 2-3 שבועות לאחר זריעה לפיתוח התנגדות מלא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את הרכב והגודל נקבובי של מוסיף משמש, לשנות במידת צורך (מומלץ להוסיף פוליאסטר, גודל נקבובי 0.3 מיקרומטר, ללא ציפויים, ראה חומרים לפרטים נוספים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את האיכות של האלקטרודה, שיוף עדין המסיר את החלבונים שהצטברו מהקצה, והחלפה במידת צורך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו בינוני להתפתחות חיידקים </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> התנגדות מתפתחת, אבל קיטוב מלא (≥ Ω × 1000 סנטימטר 2) לא הושג </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זמן נוסף לקיטוב לפתח (אולי מדי פעם לקחת עד 4 שבועות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש-3 Calu תאים שsubcultured ממניות קפוא פחות מ 10 פעמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשרו ל- 3 Calu תאים להגיע למפגש 100% בתת monolayer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקביות להחליף בינוני בתרבויות Transwell, לסירוגין בין היום הרביעי 3 ואז אחרי ההאכלה הקודמת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות יחידים במוסיף כי ממוקמות את השורות החיצוניות של צלחות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שונים בהרבה ממוסיף Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> תאים לקטב באופן מלא, אבל התנגדות אינה עקבית מקריאה אחד למשנו </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תפגעו או לערום צלחות בחממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תגרום לרעידות בארון הבטיחות הביולוגי תוך Transwell plates מטופלות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל בועות אוויר בבארות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נא לא להפריע את שכבת התא עם טיפי פיפטה כשמשתנית מדיה או ביצוע קריאות TEER </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני μl 200 בתא האפיקלי; עוצמת קול נמוכה יותר עלולה לגרום לקריאות TEER יציבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את האיכות של האלקטרודה, שיוף עדין המסיר את החלבונים שהצטברו מהקצה, ולהחליף במידת צורך </li></ul></td></tr></tbody></table> 1. בעיות טבלת פתרון בעיות, שעשוי להתעורר כאשר 3 Calu תאי culturing בTranswells. גורמים רבים תורמים לקיטוב מלא ב- 3 Calu תאים בתרבית נוזל מכוסה, הסבירה שרובם מסומנים בטבלה זו.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

הממצאים והמסקנות בדו&quot;ח זה הם של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...